Metodi molecolari per la diagnosi di laboratorio e lo studio epidemiologico delle infezioni da Giardia intestinalis, Cryptosporidium spp. e Dientamoeba fragilis

Abstract

Le malattie gastrointestinali sostenute da protozoi patogeni a trasmissione fecale-orale hanno un rilevante impatto in termini di morbilità e mortalità in tutto il mondo, con prevalenza particolarmente elevata nei Paesi in via di sviluppo. Tuttavia, tali infezioni sono diventate un problema non trascurabile per i Paesi industrializzati quali il nostro, in relazione al progressivo e costante aumento di soggetti che per ragioni diverse (turismo, lavoro, opere missionarie, etc.) si recano in aree iperendemiche e ai flussi migratori provenienti dalle stesse, oltre che all’adozione. Il nostro laboratorio infatti riceve numerosi campioni di questi soggetti e di italiani apparentemente privi di fattori di rischio, per i quali non è possibile escludere casi autoctoni di infezione. Tra i protozoi più frequentemente implicati nelle parassitosi intestinali, oltre all’ameba Entamoeba histolytica agente di amebiasi intestinale e viscerale, vi sono due protozoi riconosciuti come agenti di gastroenterite, G. intestinalis e Cryptosporidium spp., e D. fragilis, protozoo a prevalenza crescente nei Paesi industrializzati con ruolo patogeno inizialmente controverso ma ormai chiarito. La diagnosi di parassitosi intestinale, che prevede indagini convenzionali basate sull’analisi di caratteristiche morfo-strutturali e comprendenti l’esame microscopico, la coltura per protozoi ed elminti e la ricerca di antigeni, presenta limiti dovuti alla necessità di personale addestrato e alle difficoltà intrinseche dell’esame parassitologico legate prevalentemente alla scarsa sensibilità e/o specificità dei singoli metodi. Recentemente sono stati sviluppati e proposti diversi saggi di PCR, convenzionale e/o real-time, per la diagnosi di parassitosi intestinale, volti al superamento di tali limiti. Nel nostro laboratorio, dove è da tempo in atto un progetto di ricerca applicato alla diagnostica innovativa delle parassitosi e, in particolare, di quelle intestinali, è già stato sviluppato ed estesamente valutato un saggio molecolare per la diagnosi di amebiasi, con conseguente vantaggiosa applicazione nella pratica diagnostica quotidiana. In questo campo di ricerca applicata si inserisce lo scopo di questo studio che si propone di valutare 3 saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente, finalizzato alla potenziale applicazione nella pratica diagnostica quotidiana e alla definizione della reale prevalenza dei 3 protozoi nella realtà considerata, che si ipotizza sottostimata in quanto influenzata dai limiti della diagnosi mediante metodi convenzionali. I saggi di real-time PCR, aventi come bersaglio i geni codificanti per l’RNA ribosomiale dei 3 protozoi, sono stati valutati utilizzando campioni di feci appartenenti a pazienti con sospetta parassitosi intestinale inviati presso il nostro laboratorio, a confronto con i risultati ottenuti mediante metodi convenzionali di diagnosi parassitologica, quali l’esame microscopico diretto e previo arricchimento, la ricerca degli antigeni specifici di G. intestinalis e Cryptosporidium spp. mediante saggio immunocromatografico e reazione di immunofluorescenza e la coltura per protozoi per quanto riguarda la ricerca di D. fragilis. I campioni utilizzati per la valutazione dei saggi molecolari erano complessivamente 2770 di 1410 pazienti nel periodo 2006-2010. In particolare, sono stati analizzati 771 campioni di 386 pazienti inviati dal 2006 al 2008, 1040 campioni di 533 pazienti inviati dal 2006 al 2010, 959 campioni di 491 pazienti inviati dal 2006 ad Aprile del 2009, per la valutazione dei saggi per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente. Da un punto di vista analitico i 3 saggi di real-time PCR valutati si sono rivelati altamente sensibili e specifici dimostrando un limite di rivelazione corrispondente ad un ridotto numero di stadi diagnostici (cisti di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., trofozoiti di D. fragilis) nel campione di feci e assenza di reattività crociata con il DNA di altri parassiti. I saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis valutati in questo studio si sono dimostrati altamente sensibili e specifici, non solo da un punto di vista analitico ma anche da un punto di vista diagnostico, in quanto oltre a confermare i casi diagnosticati mediante metodi convenzionali hanno rilevato casi aggiuntivi; in particolare hanno rispettivamente permesso di diagnosticare 13 casi aggiuntivi di giardiasi su un totale di 106, 1 caso aggiuntivo di criptosporidiosi su un totale di 13, 60 casi aggiuntivi di dientamoebiasi su un totale di 105. I dati ottenuti dalla valutazione hanno inoltre permesso di delineare la reale prevalenza di G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, identificandoli come i 3 protozoi patogeni più frequenti tra i pazienti con sospetta parassitosi intestinale nella nostra realtà. Il saggio di real-time PCR per la diagnosi di infezione da D. fragilis, in particolare, si è dimostrato di grande utilità ed adeguato per l’applicazione alla pratica diagnostica quotidiana, in quanto quasi il 60% dei casi è stato rilevato mediante il solo saggio molecolare. Di particolare interesse è il risultato ottenuto relativamente al sequenziamento dei campioni positivi per D. fragilis, tra i quali 5 campioni presentavano una sequenza potenzialmente attribuibile al genotipo 2 ad oggi riconosciuto in soli 2 isolati al mondo. La rarità del genotipo 2 e i risultati ottenuti nel presente studio aprono la base a futuri studi mirati alla determinazione di eventuali differenze nelle modalità di trasmissione e nelle manifestazioni cliniche, tra i due genotipi noti. I saggi di real-time PCR per la ricerca del DNA di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., invece, non si sono rivelati nella nostra esperienza sufficientemente vantaggiosi rispetto ai metodi convenzionali; pertanto la loro applicazione in diagnostica potrebbe essere utile in futuro solo se inclusi in una reazione di tipo multiplex, con conseguenti vantaggi in termini di costo e di minore complessità dell’allestimento.

È stata inoltre compiuta la genotipizzazione dei ceppi di G. intestinalis identificati in questo studio, volta all’identificazione dei genotipi A e B, gli unici riscontrabili nell’uomo, eseguita attraverso l’analisi del polimorfismo nella lunghezza dei frammenti di restrizione del gene codificante per la proteina β-giardina del protozoo. La genotipizzazione di G. intestinalis ha mostrato un risultato compatibile con i dati europei ma in contrasto con i dati italiani, rivelando una maggiore prevalenza del genotipo B (66,2%) rispetto al genotipo A (33,8%), sebbene non sia stato possibile genotipizzare una parte dei campioni, probabilmente a causa del fatto che il bersaglio di amplificazione è presente in singola copia nel genoma del protozoo e/o di potenziali “mismatches” nelle sequenze complementari ai primer. In futuro eseguendo la genotipizzazione basandosi sull’analisi dei polimorfismi di diversi geni contemporaneamente potranno essere completati gli studi di genotipizzazione del protozoo chiarendo le differenze al momento osservate tra i nostri dati in accordo con quelli europei e i dati di altri studi italiani. I risultati di questo studio hanno messo a disposizione saggi pronti all’applicazione in diagnostica e dati importanti relativi all’epidemiologia delle infezioni da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis ed infine hanno contribuito ad estendere conoscenze sulla distribuzione nella nostra realtà dei genotipi di G. intestinalis e di D. fragilis che infettano l’uomo.

Gastrointestinal diseases due to pathogenic protozoa are nowadays a significant cause of morbidity and mortality worldwide, especially in developing countries. Nevertheless these infections are now an important problem in industrialised countries, such as Italy, related to a continuous and constant increase in subjects travelling to hyperendemic areas for different reasons (tourism, work, mission, ecc.), to migratory flows from the same areas, and to adoption. Our laboratory, in fact, receives a lot of samples belonging to such subjects and to Italians apparently without risk factors, for which autochthonous cases of infections could not be excluded. In the group of protozoa most frequently involved in intestinal parasitoses, besides the amoeba causing intestinal and visceral amoebiasis Entamoeba histolytica, are included Giardia intestinalis and Cryptosporidium spp., two protozoa known as gastroenteritis agents, and Dientamoeba fragilis, a protozoan with an increasing prevalence in developed countries and with a pathogenic role debated for a long time and nowadays recognized. The diagnosis of intestinal parasitosis that is founded on conventional assays based on the analysis of morphological and structural features and including microscopic examination, protozoa and helmints culture, and antigen detection, is affected by limits due to the requirements of well-trained personnel and to the intrinsic difficult of parasitologic examination, mostly based on the low sensitivity and/or specificity of conventional methods. Recently, in order to circumvent these limits, different PCR assays, both conventional and real-time, were developed for the diagnosis of intestinal parasitoses. In our laboratory, where a research project applied to the innovative diagnosis of parasitoses in particular intestinal parasitoses is under way, a molecular assay for the diagnosis of amoebiasis was already developed and widely evaluated with a subsequent and advantageous application to the daily diagnostic practice. The scope of this study is included in this applied research field since it aimed to the evaluation of 3 real-time PCR assays for the diagnosis of infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis, respectively, finalized to the application to the diagnostic practice and to the definition of the actual prevalence of the cited protozoa in our area, hypothetically underestimated due to the limits of the diagnosis by conventional methods. The real-time PCR assays, targeting the rRNA genes of the 3 protozoa, were evaluated by using faecal samples belonging to patients with the suspicion of intestinal parasitosis sent to our laboratory, as compared to conventional methods of diagnosis, such as microscopic examination of fresh and concentrated faeces, detection of specific antigen of G. intestinalis and Cryptosporidium spp. by immunocromatographic assay and direct immunofluorescence, and protozoa cultivation as concerns D. fragilis detection. The samples used for the evaluation of the real-time PCR assays were totally 2770 of 1410 patients in the period 2006-2010. In particular, 771 samples of 386 patients sent from 2006 to 2008, 1040 samples of 533 patients sent from 2006 to 2010, 959 samples of 491 patients sent from 2006 to April 2009, were analysed for the diagnosis of infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis, respectively. From an analytic point of view, the evaluated real-time PCR assays proved to be highly sensitive and specific demonstrating a detection limit corresponding to a low number of parasitic diagnostic stages (G. intestinalis and Cryptosporidium spp. cysts, D. fragilis trophozoites) in faecal specimens and absence of cross-reactivity with the DNA of other parasites. The real-time PCR assays for the diagnosis of infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis evaluated in this study proved to be highly sensitive and specific also from a diagnostic point of view, since, besides confirming of cases already diagnosed by conventional methods, they were able to reveal additional cases: in particular, 13 cases of giardiasis on a total of 106 cases, 1 case of cryptosporidiosis on a total of 13 cases, 60 cases of dientamoebiasis on a total of 105 cases, were respectively diagnosed by molecular methods. Data obtained by the evaluation of these assays gave a contribution to determining the actual prevalence of G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis, identifying them as the three most frequent protozoa among patients suspected of having intestinal parasitosis in our setting. In particular, the real-time PCR assay for the diagnosis of infection by D. fragilis, demonstrated to be very useful and adequate to the application in the daily diagnostic practice since almost 60% of cases were revealed only by it. The sequencing of D. fragilis positive samples was of interest showing 5 samples with a sequence probably assignable to the genotype 2, at the present time recognized only in 2 isolates in the world. The rarity of the genotype 2 and the results obtained in the present study are the basis for future studies for the determination of differences between the two exsistent genotypes in the way of transmission and in clinical manifestations. On the contrary, the real-time PCR assays for the diagnosis of infection by G. intestinalis and Cryptosporidium spp. did not offer sufficient advantages as compared to the conventional methods and their application could be taken into account in the future only if included in a multiplex PCR approach, with consequent advantages being less expensive and cumbersome to perform. Furthermore, in this study a genotyping for the identification of the genotypes A and B of G. intestinalis, the only two found in human strains, was performed by restriction fragment length polymorphism analysis of the β-giardin gene, on samples positive by real-time PCR. G. intestinalis genotyping revealed a result consistant with European data but in contrast with Italian ones revealing an higher prevalence of genotype B (66,2%) as compared to that of genotype A (33,8%) although it was not possible to type a portion of samples, maybe due to the fact that the genotyping PCR target was present in single copy in the protozoan genome and/or to mismatches likely occurring in the sequences complementary to primers. In the future, if the genotyping will be performed by polymorphisms analysis of different genes simultaneously, the typing of G. intestinalis will be completed in order to understand the differences between our data, according to the European ones and to data of other Italian studies. The results of this study offered assays ready-to-use in the diagnostic practice and important data as concerns to the epidemiology of the infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp., and D. fragilis, and, finally gave a contribution to broading the knowledges on the distribution in our setting of genotypes of G. intestinalis and D. fragilis infecting humans.