Looking for the holy well of tissue regeneration: isolation, characterization and differentiation into hard tissues of multipotent cells from human placenta

Abstract

The improvement of life quality and lifespan lengthening in Western countries leads as a consequence a more and more urgent need for organs and tissues replacement. As organs and tissues derived from heterologous donors are not easily available and, moreover, oblige to a life-spanning use of immunosuppressive drugs, effective alternatives are needed. The aim of this work was the investigation of the regenerative potential nested in placenta, as an ethically acceptable and promising source of multipotent cells for tissue repair. A protocol is reported that allows the isolation from placenta of a homogeneous population of human chorionic multipotent stromal cells (hCMSCs) by the combination of plastic adherence and subsequent cell sorting of CD34neg cells. This population displays the typical characteristics of mesenchymal stem cells and exhibits clonal properties, as testified by the analysis of surface markers and doubling time. As for the differentiation potential, evidence was provided on the ability of hCMSCs to differentiate into osteoblastic cells as well as into adipoblasts and chondroblasts. In particular, concerning chondrogenic differentiation, culture protocols were useful to get the induction of the expression in hCMSCs of typical chondrogenic genes, but some work still has to be done in order to obtain a clear hyaline cartilage to satisfy the target of articular cartilage regeneration. Moreover hCMSCs possess an osteogenic potential if cultivated in appropriate conditions. When a canonical osteoinductive medium was used, differentiation towards the osteogenic lineage was scanty and only small calcified nodules were visualized. In order to improve these results, cells were grown in the presence of collagen or Bio-oss® as substrates. Collagen didn’t influence gene expression of hCSMCs, while the presence of Bio-oss®, especially if combined with an osteogenic medium, allowed better differentiation and maturation of cells into osteoblasts or osteocytes. In experiments performed on a rat model of critical size defect, hCMSCs confirmed their ability to settle and proliferate on Bio-oss® scaffolds. Moreover those cells were able to fill the created defect by forming a soft compact tissue. On the whole, data collected in this PhD thesis suggest that placenta could be an effective and abundant source of cells for tissue regeneration.

Il miglioramento della qualità e l’allungamento dell’aspettativa di vita nei Paesi occidentali comportano una sempre più urgente necessità di sostituire organi e tessuti. Dato che le donazioni di organi sono assolutamente insufficienti e che, inoltre, il trapianto eterologo obbliga all’assunzione per tutta la vita di farmaci immunosoppressori, appare evidente la necessità di fonti alternative di tessuti. Lo scopo dello studio era l’analisi del potenziale rigenerativo insito nella placenta umana, considerata una fonte eticamente accettabile ed estremamente promettente di cellule multipotenti per la rigenerazione tissutale. La tesi riporta un protocollo che consente l’isolamento dalla placenta di una popolazione omogenea di cellule multipotenti stromali (hCMSCs) grazie alla combinazione di adesione su plastica e successiva selezione immunomagnetica delle cellule CD34-. Questa popolazione mostra le caratteristiche tipiche delle cellule mesenchimali e possiede proprietà clonali, come testimoniato dall’analisi dei markers superficiali e dai tempi di duplicazione. Per quanto riguarda il potenziale differenziativo, si dimostra che le hCMSCs sono in grado di differenziare in adipoblasti, condroblasti e osteoblasti. In particolare, a proposito del differenziamento cartilagineo, sono stati adottati protocolli di coltura utili all’ottenimento dell’induzione dell’espressione da parte delle hCMSCs di geni tipici del tessuto cartilagineo. Tuttavia, il tessuto ottenuto mostra caratteristiche fibrocartilaginee, che suggeriscono la necessità di migliorare ulteriormente le condizioni di differenziamento al fine di ottenere un sostituto funzionale per la cartilagine ialina articolare. Inoltre le hCMSCs sono in grado di differenziare in tessuto osseo, se opportunamente trattate. L’utilizzo di un medium osteoinduttivo classico produce solo un modesto differenziamento e una scarsa deposizione di noduli calcificati. Per migliorare tali risultati le cellule sono state coltivate in presenza di collagene o Bio-oss® come substrati. Il collagene non influisce sull’espressione genica delle hCMSCs, mentre la presenza Bio-oss®, specialmente se associata ad un medium osteogenico adeguato, consente un differenzamento più completo ed una migliore maturazione delle cellule in osteoblasti e osteociti. Negli esperimenti condotti in vivo su un modello murino di difetto critico le hCMSCs hanno confermato la capacità di colonizzare gli scaffold di Bio-oss® e di proliferare su di essi. Inoltre tali cellule sono state in grado di colmare il difetto creato originando un tessuto molle compatto. Nel complesso i dati raccolti in questo lavoro di tesi suggeriscono che la placenta può costituire effettivamente una fonte utile ed abbondante di cellule per la rigenerazione tissutale.