Batteri lattici non starter durante la stagionatura del formaggio: sopravvivenza, crescita e produzione di molecole potenzialmente coinvolte nella formazione dell'aroma

Abstract

I batteri lattici (LAB) costituiscono un gruppo eterogeneo di batteri tradizionalmente utilizzati nella produzione di formaggi. Essi possono svolgere diversi ruoli durante la caseificazione, gli starter LAB (SLAB) sono i protagonisti del processo di fermentazione, mentre i non starter LAB (NSLAB) esplicano il loro ruolo durante la maturazione del formaggio. Il lavoro di ricerca di questo dottorato si è focalizzato sullo studio del contributo dei NSLAB durante la stagionatura del formaggio. In particolare è stato preso in esame uno dei più famosi formaggi Italiani a lunga stagionatura, il Parmigiano Reggiano. Durante la maturazione del formaggio gli SLAB muoiono e lisano di conseguenza; i NSLAB, invece, iniziano a crescere e si sviluppano durante la stagionatura. Durante il periodo di maturazione del Parmigiano Reggiano i NSLAB crescono in mancanza di zuccheri del latte, perché il lattosio è già stato consumato dagli SLAB durante le fasi iniziali della produzione del formaggio. La capacità dei NSLAB di sopravvivere e crescere in queste condizioni potrebbe essere dovuta alla loro abilità di utilizzare fonti energetiche alternative, come i prodotti derivanti dalla lisi cellulare dei SLAB. Il primo studio riportato in questa tesi di dottorato, ha confermato la capacità dei NSLAB di sopravvivere e crescere utilizzando come fonte di energia solo i prodotti di lisi cellulare degli SLAB. Gli esperimenti condotti per sostenere questa ipotesi hanno dimostrato che i prodotti derivanti dalla lisi di L. helveticus (SLAB) possono fornire nutrienti sufficienti a consentire la crescita in vitro di due specie di NSLAB, L. casei e L. rhamnosus. Inoltre, l’osservazione di cambiamenti nella composizione del prodotto di lisi degli SLAB dopo la crescita dei NSLAB, suggerisce che alcuni composti possano essere consumati o prodotti dal metabolismo della microflora non starter durante la crescita. Ulteriore scopo di questa tesi di dottorato è stato indagare se il metabolismo dei NSLAB, che crescono utilizzando le fonti di nutrimento disponibili nel formaggio stagionato, potesse contribuire alla produzione di molecole volatili coinvolte nella formazione del flavour del formaggio. I risultati ottenuti hanno portato a supporre che molte molecole importanti, che contribuiscono al flavour, derivino da vie metaboliche seguite dai NSLAB, come il metabolismo del lattato/citrato, il catabolismo degli aminoacidi e degli acidi grassi liberi e dall’uso dei pochi zuccheri contenuti nel formaggio stagionato (come N-acetilglucosamina derivante dalla parete cellulare degli SLAB). La presenza di questi composti volatili ha confermato che, durante la stagionatura, la microflora NSLAB contribuisce a sviluppare l’aroma del formaggio. Infine, è stata valutata la capacità dei LAB di sintetizzare nuove molecole, coinvolte nell’aroma caratteristico del formaggio, γ-glutamil-amminoacidi e lactoyl-amminoacidi. E’ stato osservato che, L. helveticus, scelto come rappresentante della microflora starter, e L. rhamnosus, rappresentante dei NSLAB, sono in grado di produrre sia γ-glutamil-fenilalanina e lactoyl-fenilalanina grazie probabilmente ad una particolare un'attività enzimatica batterica. Mentre il primo composto è stato prodotto solo dalle cellule dopo lisi, la lactoyl-fenilalanina è stata prodotta dalle cellule dei LAB sia durante la crescita che dopo lisi, in quantità diverse a seconda della specie, della condizione cellulare e del tempo di incubazione. Vista la bassa resa delle reazioni, la maggiore quantità di queste molecole, che si trova nel formaggio, potrebbe essere una conseguenza del loro accumulo durante il lungo periodo di maturazione che caratterizza i formaggi a lunga stagionatura. Le capacità dei NSLAB e le loro attività durante la maturazione del formaggio si sono rivelate molto interessanti e potrebbero trovare una applicazione tecnologica nella produzione di formaggi o altri prodotti fermentati stagionati. In particolare, lo studio e la conseguente conoscenza delle abilità specie-specifiche dei NSLAB che portano alla formazione di composti aromatici, potrebbero essere di grande interesse per i produttori di formaggi in tutto il mondo.

Lactic Acid Bacteria (LAB) constitute a heterogeneous group of bacteria that are traditionally used in cheese manufacturing. They may play different roles in cheese-making where starter LAB (SLAB) participate in the fermentation process, whereas non starter LAB (NSLAB) are implicated in cheese ripening. This PhD thesis focused on NSLAB role during cheese ripening, in particular in a famous long ripened cheese, Parmigiano Reggiano. During ripening the death and lysis of SLAB (the dominant microflora at the culmination of curd acidification) and the growth of NSLAB, occur. In Parmigiano Reggiano cheese NSLAB grow in lacking sugars conditions, because the lactose has already been exhausted by SLAB during the initial step of cheese making. The ability of NSLAB to survive in these conditions could be due to their particular capabilities to use alternative energy sources, such as the SLAB cell lysis products. The first study reported in this PhD thesis, confirmed the NSLAB ability to survive and grow using as nutrient source only SLAB cell lysis products. In fact, the experiments conducted to sustain this hypothesis confirmed that L. helveticus (SLAB) lysate products provide sufficient nutrients to allow the growth of two NSLAB species, L. casei and L. rhamnosus, in vitro. Furthermore the changes in the SLAB lysis product composition suggest that some compounds can be either consumed or produced by bacterial metabolism during growth. Secondly this PhD research aimed to investigate if the NSLAB metabolism in these lacking sugar conditions, could contribute to the production of volatile molecules involved in cheese flavour formation. The “volatilomes” of L. rhamnosus and L. casei, grown using SLAB cell lysis products or a cheese model medium, were studied. The results allowed to suppose that some important molecules, involved in flavour formation, can be derived from NSLAB metabolic pathways, such as lactate/citrate metabolism, amino acids catabolism, free fatty acids metabolism and from the use of the few sugars contained in ripened cheese (i.e. N-acetyl glucosamine from SLAB cell wall). The presence of these volatile compounds confirmed that, during aging, the NSLAB contribute to develop flavour of ripened cheese. Finally, the ability of LAB to synthesize specific new molecules, γ-glutamil-amino acids and lactoyl-amino acids, potentially involved in flavour was evaluated. It was observed that, L. helveticus, representative of SLAB, and L. rhamnosus, representative on NSLAB, were able to produce both γ-glutamyl-phenylalanine and lactoyl-phenylalanine by enzymatic activity. While the first molecule was produced only by lysed cells, the latter was produced either by growing or lysed cells in different amount depending on the species, the cell condition and time of incubation. Having regard to the low yield of the reactions, the greater amount of these compounds, found in cheese, is a consequence of the long time of ageing and of the accumulation of the amino acidic precursors. The observed abilities of NSLAB and their activities during cheese ripening could be harnessed to several technological extents. In particular, the description of species specific features involved in flavour formation could be of great interest for the worldwide cheese producers.