Unraveling Mitochondrial Biogenesis in Saccharomyces cerevisiae: Genomics, Genetics and Biochemical Approaches

Abstract

I mitocondri, oltre al classico ruolo di centrali energetiche delle cellule, sono organelli di vitale importanza in molti altri processi come invecchiamento e apoptosi. Esiste un esteso scambio di informazioni tra genoma nucleare e mitocondriale che permette di integrare il metabolismo mitocondriale nel network cellulare. Tutti i processi che concorrono nello stabilire una corretta funzionalità mitocondriale e una sua corretta integrazione sono collettivamente noti come “biogenesi mitocondriale”. Il lievito S. cerevisiae è stato uno degli organismi modello più estensivamente utilizzati nella ricerca in campo mitocondriale e molti approcci sono stati utilizzati per identificare geni nucleari coinvolti nel metabolismo mitocondriale. Negli ultimi anni analisi high throghput sono diventate molto comuni ma nonostante la grande quantità di informazioni raccolte il proteoma mitocondriale è ancora lontano dall’essere completato. Abbiamo eseguito uno screening genomico incentrato sull’identificazione di geni nucleari coinvolti nella biogenesi mitocondriale. Tenendo presente che alcuni mutanti mitocondriali esprimono un fenotipo evidente solo in condizioni di stress e ipotizzando che le numerose analisi riportate in letteratura, condotte sempre alla temperatura ottimale di 30ºC, potessero aver sottostimato il numero di geni coinvolti, abbiamo eseguito le analisi alla temperatura di 37ºC. Utilizzando un terreno ricco in presenza di etanolo come fonte di carbonio e analizzando la crescita a 30 e 37ºC abbiamo identificato 488 geni la cui delezione comporta un difetto ossidativo. Attraverso un processo di filtraggio dei dati e conferme sperimentali abbiamo selezionato 177 geni mai correlati alla funzionalità mitocondriale o la cui funzione fosse ancora parzialmente o totalmente sconosciuta. Per la maggior parte di questi il fenotipo osservato era specifico a 37ºC. Abbiamo inoltre dato una prima caratterizzazione del difetto OXPHOS analizzando lo stato dei citocromi respiratori e il consumo di ossigeno, raggruppando i candidati in quattro classi fenotipiche che descrivessero la severità dei fenotipi osservati. Differenti fattori di trascrizione, modificatori istonici e pathway cellulari si sono rivelati arricchiti nel nostro dataset a 37ºC. Modificazione dei tRNA citoplasmatici, acetilazione N-terminale e pathway di risposta al pH alcalino sono tra gli identificati. Una importanza funzionale di questi processi nella biogenesi mitocondriale in condizioni di stress è stata quindi provata per la prima volta. Uno dei pathway più interessanti è quello riguardante la modificazione di tRNA citoplasmatici nella posizione wobble dell’anticodone, arricchito a 37ºC. Per questo processo non era mai stata mostrata una connessione con la biogenesi mitocondriale. Abbiamo quindi esplorato la possibilità che tRNA modificati da questo pathway potessero essere essenziali per la sintesi proteica mitocondriale a 37ºC. Studiando tre particolari mutanti in geni rappresentativi delle tre reazioni fondamentali di modificazione siamo stati in grado di dimostrare chiaramente che la sintesi proteica mitocondriale è regolata da questo pathway. Il meccanismo molecolare sottostante rimane però ancora sconosciuto. Infine è stato caratterizzato funzionalmente un singolo gene la cui delezione è causa di difetti OXPHOS a 37ºC. Codifica per una proteina mitocondriale a funzione sconosciuta partner ipotetico della ossidoreduttasi Arh1. Il mutante nullo nel gene YIR024C è stato sottoposto ad una estensiva caratterizzazione biochimica che ne ha messo in luce differenti difetti nella catena respiratoria mitocondriale. Le subunità del complesso IV codificate nel genoma mitocondriale (Cox1, Cox2 e Cox3) e il Cytb si sono rivelati fortemente abbattuti a 37ºC come le attività enzimatiche dei rispettivi complessi. Inoltre nelle stesse condizioni anche il profilo del heme mitocondriale mostrava difetti. Abbiamo costruito un ceppo in grado di esprimere una versione della proteina recante al suo C terminale un tag di riconoscimento. In questo modo ne abbiamo determinato la localizzazione mitocondriale, la topologia e il peso nativo. Queste analisi hanno confermato che Yir024c è una proteina mitocondriale di membrana interna, che espone nello spazio intermembrana un dominio globulare di 152 aminoacidi. Il peso nativo si è rivelato essere circa 250Kda, indicativo di appartenenza ad un complesso proteico. L’ipotetico partner fisico Arh1 però non è stato identificato nello stesso complesso e inoltre non è stata osservata alcuna co-precipitazione in studi di affinità. Questo ci ha permesso di concludere che i due prodotti proteici non interagiscono fisicamente. Per identificare i partner funzionali di Yir024c il complesso di 250Kda è stato purificato e sottoposto ad analisi di spettrometria di massa, ancora in corso di svolgimento.

Mitochondria, besides their well-known role of “powerhouses” of the cell, is a central organelle in many others cellular processes as aging and apoptosis. An extensive interplay occurs between nuclear and mitochondrial genome, and allows cells to integrate mitochondrial metabolism in the cellular network. All the processes that concur to proper mitochondrial functionality and integration are collectively known as “mitochondrial biogenesis”. The yeast S. cerevisiae has been one of the most used model organism for mitochondrial research and many approaches have been used to identify nuclear genes involved in mitochondrial metabolism and in the last few years genome-scale approaches became very popular. However, the yeast mitochondrial proteome is still not totally covered. We performed a genome-wide screening focused on identification of nuclear genes involved in mitochondrial biogenesis. Knowing that certain genes express mitochondrial phenotypes only in stressful conditions we carried out the analysis at 37˚C postulating that previous published results, obtained in experiments at 30˚C, could have underestimated the number of nuclear genes involved in such processes. Using complete ethanol media and analysing growth at 37˚C and 30˚C we identified 488 genes whose deletion led to a defect. Through data mining and experimental confirmation we generated a list of 177 nuclear genes that were previously not linked to mitochondrial biogenesis or with a mitochondrial role still poorly understood. For the majority of those the mitochondrial phenotype was expressed only at 37˚C. Furthermore we gave a first characterization of the OXPHOS defect analysing cytochromes content and oxygen consumption, creating 4 phenotypical classes to depict the different impairments observed. Interestingly several histone modifiers, transcriptional factor and cellular pathways were specifically enriched in our dataset at 37˚. Cytoplasmic tRNAs chemical modification, N-terminal protein acetylation and alkaline pH sensing were among the pathways identified. A functional importance of such processes in mitochondrial biogenesis under stress is for the first time discussed. A particular attention has been given to one of the pathways identified in the described screening. Indeed enrichment in the pathway of chemical modification in wobble bases of cytoplasmic tRNAs was very interesting since a relation between this process and mitochondrial biogenesis was never shown. We explored the possibility that tRNAs modified in this pathway could be essential for mitochondrial protein synthesis at 37˚C studying in particular the effects of three deletions in genes representative of the three different steps of the pathway. We were able to demonstrate clearly that under stress the mitochondrial protein synthesis is regulated by cytoplasmic tRNAs chemical modification, although the molecular mechanisms underlying are still uncertain. Finally we functionally characterized YIR024C, identified in the aforementioned screening as gene whose deletion caused OXPHOS defects at 37˚C. It codes for a mitochondrial protein of unknown function, a hypothetical interactor of Adrenodoxin Reductase (Arh1p). Through extensive biochemical characterization a yir024c null mutant was found to have several mitochondrial respiratory chain defects. Mitochondrial encoded subunits of complex IV (Cox1p, Cox2p and Cox3p) and Cyt b were markedly decreased at 37˚C, along with corresponding enzymatic activities. Also mitochondrial heme profile showed impairments in the same conditions. We obtained a strain expressing an epitope-tagged version of the protein, used to determine the mitochondrial localization, topology and the native size. These analyses confirmed that Yir024c is a mitochondrial protein, integral to the inner membrane and exposing a globular domain of 152 amino acids in the inter membrane space. The protein revealed a native size of about 250Kda, indicating that it resides in a complex. We failed in confirming the predicted physical interaction with Arh1p as this protein was not part of the same complex of Yir024cp and was not found to co-precipitate in affinity purification studies. To identify Yir024cp functional partners the 250Kda complex was purified and mass spectrometry analyses are in progress.