http://hdl.handle.net/1889/669 Wed, 19 Jun 2013 14:44:03 GMT 2013-06-19T14:44:03Z http://hdl.handle.net/1889/1961 Title: Alimentazione e fertilità nella bovina da latte Authors: Rossi, Federico Abstract: Nutrition has an important impact on the reproductive performance of dairy cattle. Energy is the major nutrient required by adult cattle and inadequate energy intake has a detrimental impact on reproductive activity of bovine. Cows under negative energy balance have extended periods of anovulation. Postpartum anestrus, as well as infertility, is magnified by losses of body condition during the early postpartum period. Resumption of ovulatory cycles is associated with energy balance, but seems to be mediated by a rise in plasma IGF-I; which is linked to nutritional status and concentrations of insulin in blood. Feeding diets that promote higher plasma glucose and insulin may improve the metabolic and endocrine status of cows. Feeding behavior of dairy cows during the transition period, particularly a decline in feed intake prior to calving, is associated with risk of postpartum uterine disease, such as metritis. Because metritis has a profound negative effect on risk of pregnancy in dairy cows, providing adequate bunk space and environment to maximize feed intake is expected to minimize the risk of uterine diseases and improve fertility. The aim of this tesis was to investigate the relationships between nutrition and management on reproductive efficiency and metabolism of transition dairy cows. The first study used lactating dairy cows to examine the effects of silymarin from Milk Thistle on metabolism, production, milk composition and fertility of dairy cows. The second experiment investigated the effects of salicin from willow on metabolism, production and milk composition. The reproductive indices were also been collected. In the last study, length of dry period was correlated with body condition score and energy balance of transition cows. Furthermore, the relationship between dry period length and performance of dairy cows was examined (production, milk composition and fertility). Sat, 31 Mar 2012 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1961 2012-03-31T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1959 Title: Studio biomeccanico delle andature del cavallo in funzione dell'attitudine Authors: Ranieri, Alessia Abstract: Biomechanics studies the mechanical laws that govern living arganism, is divided into two main branches: Kinetic and Kinematic. Kinetic analysis measures locomotor forces, both internal and external to the body; Kinematic analysis quantifies the features of gait that are assessed qualitatively during a visual examination. The output is in the form of temporal (timing), linear (distance) and angular measurements that describe the movements of the body segments and joint angles. In this study the bidimensional kinematics parameter at trot and walk of Bardigiano horses, an Italian horse breed, are considered, in order to analyze gait in field condition, calculate a genetic “gait” index, verify heritabilities of linear measurements and check if there is a correlation between gait analysis and the score obtained in the Performance Test. The recordings were made using a video digital camera. Images were transferred and analyzed using SIMI Reality Motion Sistem. We analyzed fourteen horses to calculate angular measurements, and sixty-eight for linear measurement. We calculated a genetic “gait” index for the following parameters: Stride length forelimb and hindlimb; Overtracking; Posterior and Anterior phase both fore and hindlimb. This measurements showed medium-high heritability and were positively and significantly correlated with judgements obtained in the Performance Test.; RIASSUNTO: Questa tesi riguarda l’analisi cinematica bidimensionale dell’andatura del cavallo Bardigiano in condizioni di campo. Inizialmente abbiamo rilevato misurazioni angolari su quattordici soggetti, otto stalloni e sei femmine. In un secondo momento , utilizzando un campione più ampio di sessantotto soggetti (trentatré maschi e trentacinque femmine) abbiamo rilevato i seguenti parametri lineari: Lunghezza totale della falcata anteriore e posteriore, le rispettive fasi anteriore e posteriore e l’Overtracking. Lo scopo principale è stato quello di ricavare un indice genetico “andatura” dall’analisi del movimento, rilevando nel contempo la percentuale di ereditabilità dei caratteri considerati, per poter proporre un metodo di selezione precoce di questi soggetti; inoltre, abbiamo ricercato eventuali correlazioni con i giudizi dati da giudici ed esperti di razza in merito ai soggetti da noi inclusi nello studio che avevano partecipato al Performance Test della razza. Le riprese sono state effettuate con una videocamera digitale da 50 Hz e successivamente analizzate grazie al programma SIMI Reality Motion Sistem. Sat, 31 Mar 2012 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1959 2012-03-31T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1954 Title: Tecniche di allevamento della bovina e produzione del latte Authors: González Torres, Yesid Orlando Abstract: Lo scopo di questo studio era di analizzare la regressione lineare della dimensione delle particelle della dieta, rumine e feci con la percentuale di sostanza secca ritenuta in setacci aventi maglie di dimensioni variabili e stabilire la dimensione critica delle particelle presenti nei vari tratti dell’apparato gastroenterico delle bovine da latte; i riultati ottenuti sono stati impiegati per la scelta dei setacci per l'analisi del processo digestivo a partire dalle particelle fecali. Lo studio è stato condotto a partire da 8 ricerche indipendenti. Sono stati incluse solo le ricerche in cui erano riportate la distribuzione delle dimensioni delle particelle contenute nei diversi tratti dell’apparato gastroenterico nonché dei mangimi, del rumine e delle feci espresse in percentuale sulla sostanza secca. L’analisi statistica dei dati è avvenuta attraverso il calcolo della regressione lineare della percentuale di sostanza secca sulle diverse categorie dimensionali individuate. È stata inoltre valutata la correlazione di Pearson fra le due tipologie di dati. In totale sono state individuate un numero di 3 regressioni con le relative equazioni. Ponendo l’uguaglianza fra le le equazioni lineari descriventi la distribuzione delle particelle di dieta e rumine, dieta e feci e rumine e feci a coppie, è stato osservato che i punti di intersezione sono a 8,64 mm, 0,62 mm e -3,26 mm. Mon, 16 Apr 2012 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1954 2012-04-16T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1950 Title: Controllo della contaminazione microbica nella filiera avicola Authors: Di Ciccio, Pierluigi Aldo Abstract: L’incidenza delle malattie enteriche nell’uomo causate dal consumo di alimenti contaminati da microrganismi patogeni è ancora oggi elevata nei Paesi industrializzati. Tali tossinfezioni alimentari sono frequentemente ascrivibili al consumo di carni di pollame poco cotte. Accanto a specie saprofite e alteranti, il cui sviluppo incide sulla shelf-life del prodotto, vi é una ricca flora potenzialmente patogena responsabile delle principali infezioni e/o tossinfezioni alimentari. E’ noto che i microrganismi possono aderire efficacemente sia ai tessuti muscolari ed alla cute, sia alle superfici dell’ ambiente di lavorazione delle carni e formare biofilm. Il biofilm è un complesso biologicamente attivo costituito da un insieme di cellule microbiche irreversibilmente associate con una superficie e immerse in una matrice extracellulare (EPS). Esso rappresenta un importante fattore di sopravvivenza microbica in quanto conferisce protezione nei confronti di stress fisici e chimici e permette ai microrganismi di persistere negli ambienti di produzione. Il biofilm presente sulle superfici delle carni o negli ambienti di lavorazione costituisce un notevole problema igienico- sanitario in quanto fonte di contaminazione crociata e/o di contaminazione post-processo. Per talune linee produttive quali quella della lavorazione del pollame, inoltre, la corretta applicazione delle buone norme di produzione (GMP) e l’ applicazione del sistema HACCP non sono in grado di fornire sufficienti garanzie igienico-sanitarie. Tale problematica insieme alle attuali richieste dei consumatori in merito alla sanità degli alimenti hanno accresciuto l’esigenza di trovare sistemi alternativi per la garanzia della salubrità e della qualità microbiologica delle carni. Negli ultimi anni, infatti, l’interesse verso lo sviluppo di procedure innovative per la decontaminazione delle carni è aumentato notevolmente. Tra le sostanze che hanno suscitato maggior interesse è da considerare l’ozono. L’ozono è un gas instabile composto da tre atomi di ossigeno (O3) ed è presente allo stato naturale nell’atmosfera. E’ uno dei più potenti disinfettanti conosciuti ed ha il più alto potere ossidante. La membrana cellulare dei batteri è il “target” principale della sua azione antimicrobica; è molto efficace anche a basse concentrazioni nei confronti di un’ampia gamma di microrganismi; non lascia residui e/o sottoprodotti tossici. Nonostante l’ozono sia un composto largamente utilizzato in Europa come sanitizzante delle acque, scarse sono le informazioni e le pubblicazioni relative all’inattivazione dei microrganismi mediante l’applicazione dell’ozono in fase gassosa. GLI OBIETTIVI DEL PROGRAMMA DI RICERCA SONO STATI: • Valutare l’efficacia del trattamento di decontaminazione con ozono gassoso nei confronti di microrganismi isolati da carni avicole e relativi impianti di macellazione e lavorazione. • Valutare l’efficacia del trattamento di decontaminazione con ozono gassoso nei confronti di microrganismi isolati da carni avicole e relativi stabilimenti di macellazione e lavorazione a tempi e concentrazioni applicabili nelle Realtà Produttive. • Valutare la capacità dei ceppi isolati a produrre Biofilm. • Testare gli effetti dell’ozono gassoso sulla produzione e/o inattivazione del Biofilm prodotto dai ceppi isolati. Wed, 29 Feb 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1950 2012-02-29T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1581 Title: Meccanismi di controllo fisiologico e potenziali interferenti nel processo di angiogenesi follicolare Authors: Baioni, Laura Abstract: La funzionalità del follicolo ovarico è dipendente dall’azione di numerosi fattori che ne regolano l’attività agendo sulle cellule che lo compongono. Fra queste un ruolo chiave è svolto dalle cellule della granulosa. Esse infatti intervengono in diversi processi e, fra questi, quello angiogenico occupa un posto di rilievo. Gli studi sperimentali descritti in questa tesi sono stati condotti utilizzando come modello il follicolo antrale suino ed impiegando un saggio biologico di angiogenesi in vitro. Lo scopo è stato quello di indagare il ruolo svolto nella regolazione fisiologica dell’angiogenesi follicolare di tre fattori proteici, la Stanniocalcina-1, la Netrina-1, e Prolattina e, di contro, la potenziale azione interferente sul processo fisiologico di due sostanze esogene, ma potenzialmente in grado di raggiungere il follicolo, il Gossipolo e il Bisfenolo A. Inoltre, questo sistema sperimentale è stato utilizzato per indagare le propriètà biologiche di analoghi di sintesi del Resveratrolo e dei Lignani, potenziali agenti terapeutici per l’angiogenesi patologica. I risultati ottenuti hanno evidenziato che la Stanniocalcina-1, la Netrina-1 e la Prolattina rappresentano potenziali regolatori fisiologici locali dell’angiogenesi follicolare. Per quanto riguarda il Gossipolo e il Bisfenolo A, modulando l’attività funzionale delle cellule della granulosa, potrebbero causare un’alterazione del controllo fisiologico dei processi follicolari. Infine, gli analoghi di sintesi del Resveratrolo e dei Lignani hanno mostrato proprietà biologiche di estremo interesse nell’ottica di un loro potenziale utilizzo a scopo terapeutico.; Ovarian follicle function is dependent on many factors that act on its cells to regulate their activities. In particular, a pivotal role is played by granulosa cells. Indeed, they are involved in different processes and, among these, angiogenesis have an important role. The experimental studies described in this thesis were conducted employing as a model the swine antral follicle and an in vitro angiogenesis bioassay. The aim was to investigate the role of proteins namely Stanniocalcin-1, Netrin-1, and Prolactin in the physiological regulation of follicular angiogenesis and, conversely, the potential interfering action on the physiological process of Gossypol and Bisphenol A, exogenous compounds virtually able to reach the follicle. In addition, this experimental system was used to investigate the biological functions of synthetic analogues of resveratrol and lignans, promosing therapeutic agents for pathological angiogenesis. The results showed that Stanniocalcin-1, Netrin-1 and Prolactin are likely local physiological regulators of follicular angiogenesis. As for Gossypol and Bisphenol A, they might change the physiological regulation of follicular processes modulating granulosa cells function. Finally, synthetic analogues of resveratrol and lignans have shown biological properties of great interest in view of their future therapeutic use. Thu, 31 Mar 2011 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1581 2011-03-31T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1578 Title: Fattori genetici nella scelta di nuovi parametri qualitativi del latte con particolare riguardo alla sua attitudine tecnologico-casearia Authors: Nicoletti, Chiara Abstract: Migliorare la qualità del latte è una sfida che le Associazioni Nazionali Allevatori Italiane hanno intrapreso con vigore negli ultimi anni: solo stimolando gli allevatori a produrre un latte idoneo alla caseificazione e, quindi, particolarmente adatto alla produzione di prodotti lattiero caseari di esclusivo valore sarà possibile diversificare le produzioni e contrastare quindi il fenomeno dell’omologazione di tutti i prodotti caseari. E’ risaputo come la produzione di latte sia diversa a seconda della razza bovina allevata, sia in termini quantitativi che qualitativi. Ma la diversa composizione del latte non è sufficiente per indicare una differente predisposizione alla trasformazione casearia delle singole razze. Attualmente negli indici di selezione delle varie razze sono inseriti vari parametri legati alla qualità del latte. I chilogrammi di proteina prodotti dalla singola vacca sono un indicatore diretto della quantità di formaggio che si può ottenere per ogni singolo animale. Questa informazione, però, risulta solo un’indicazione di carattere generale, non sufficiente per indicare esattamente la quantità e la qualità del formaggio prodotto dal latte di ogni singola bovina. Il contenuto percentuale di proteina fornisce un dettaglio maggiore perché è connesso sia alla qualità delle produzioni che allo sforzo metabolico richiesto alla bovina per una tale produzione. La variante genetica della k-caseina è un altro elemento fondamentale che ha importanti riflessi sulla resa alla caseificazione. Tutti questi parametri, senza dimenticare il contenuto in grasso e le cellule somatiche, sono certamente importanti ma non sono però sufficienti per indicare la reale qualità casearia del latte. Scopo di questa ricerca è individuare nuovi parametri qualitativi e sviluppare nuovi strumenti in grado di descrivere con maggior precisione le caratteristiche tecnologico-casearie del latte. Analizzando le differenze genetiche esistenti tra le bovine per tali parametri, si vuole, inoltre, studiare la possibilità di intervenire con azioni selettive per variare l’assetto genetico degli animali in produzione al fine di ottimizzare la resa casearia e la qualità del prodotto finito. Per far ciò, in primo luogo, si è presa in considerazione la caseina del latte, un carattere conosciuto da lungo tempo ma per cui solo negli ultimi anni è possibile analizzarne di routine il contenuto su campioni di singole vacche a prezzi contenuti. L’obiettivo principale di questo studio è stato quello di analizzare i vantaggi ottenibili, per la razza Bruna, selezionando direttamente sul valore di caseina anziché su quello di proteina. E’ la caseina, infatti, che influisce sulla resa della trasformazione casearia e la qualità del formaggio (Pecorari et al., 1990). E’ stato dimostrato che l’indice di caseina, ovvero il rapporto tra il contenuto di caseina e il contenuto di proteina grezza, può variare anche in maniera consistente da un animale all’altro (con valori che variano da 70 a 85) con differenze significative nelle caratteristiche casearie del latte prodotto. I risultati ottenuti mostrano che la selezione effettuata negli ultimi decenni sulla produzione di proteina, ha avuto nella Razza Bruna effetti molto positivi anche sulla caseina. Il progresso genetico della % di caseina, infatti, è di 0,91 deviazione standard in 10 anni ovvero il 30% più alto se comparato con quello della % di proteina (0,66 ds). Spostando l’enfasi relativa dell’indice di selezione dalle proteine alle caseine si evidenzia un aumento del progresso genetico sia dei kg di latte prodotto che di tutti i parametri che garantiscono una buona resa casearia sia in termini qualitativi che quantitativi: +0,20 % di deviazione standard genetica per i kg di latte, +0,16% per i kg di caseina e +0,11 per la % di caseina. La k-caseina è un altro importante parametro che denota le qualità casearie del latte prodotto da una singola bovina. La variante B influenza positivamente le caratteristiche tecnologiche e la “lavorabilità” del latte, migliora la resa casearia nonché la qualità del formaggio. Le metodiche utilizzate finora per determinare sia il tipo di variante presente nel campione che il contenuto relativo della stessa richiedono, però, l’utilizzo di apparecchiature sofisticate e di personale specializzato, i tempi di analisi sono lunghi e i costi piuttosto elevati. Per questo motivo si è lavorato per creare un test di analisi rapido (Test Kappa) che riesca a quantificare il contenuto di k-caseina B in campioni di latte di massa con costi contenuti e tempi d’analisi compatibili con la routine di laboratorio. Potendo poi misurare il contenuto in k-caseina B, grazie al test kappa, sul latte di massa, si è dato il via ad un ulteriore studio per approfondire le conoscenze su questo parametro completamente nuovo. L’obiettivo del progetto è verificare la variabilità, durante l’anno, del contenuto in k-caseina B nel latte di massa ed evidenziarne eventuali differenze dovute alla razza e alla dimensione dell’allevamento. I risultati hanno dimostrato che, in generale, il contenuto di k-caseina B nel latte di caldaia è un parametro molto più costante durante l’anno rispetto agli altri caratteri qualitativi perché è influenzato direttamente dalle caratteristiche genetiche della mandria. Per quanto concerne le dimensioni d’allevamento, le aziende piccole mostrano una maggiore variabilità per il contenuto di k-caseina B rispetto alle medio grandi. Ci sono, infatti, piccoli allevamenti che hanno una % media di k-caseina B di 0,09 ma altri che arrivano addirittura a sfiorare lo 0,40 dimostrando quindi una spiccata attenzione alle caratteristiche genetiche degli animali presenti in stalla. Le grosse aziende hanno invece un range di variazione del contenuto di k-caseina B molto più contenuto (da 0,18 a 0,30). Per quanto riguarda la razza, gli allevamenti composti da animali con un’elevata frequenza di k-caseina B, presentano un’oscillazione dei valori per il contenuto di k-caseina B molto più ampia ( da 0 a 0,42) rispetto a quelli di razza con bassa frequenza (da 0 a 0,20). Sempre considerando il latte di massa, si è valutato come variazioni discrete del contenuto in k-caseina B influenzino anche le caratteristiche casearie del latte. I risultati mostrano un forte legame di questo parametro con il tempo di rassodamento e la consistenza del coagulo. Infatti lavorando latte con contenuto di k-caseina B intorno al 6% rispetto ad uno con sola k-caseina A, il tempo di rassodamento passa da 12 a 4 minuti e la consistenza del coagulo da 23 a 38 mm. Il contenuto di k-caseina B non sembra, invece, particolarmente legato al tempo di coagulazione che sembra influenzato più dal pH e dall’acidità. Nel seguente studio si è voluto verificare l’utilizzo del Test Kappa calcolando il contenuto di k-caseina B anche su latte di singole vacche. I risultati sono stati confortanti perché, analizzando su tutti i campioni l’andamento della % di k-caseina B, calcolata come rapporto fra il contenuto di k-caseina B misurato col “test kappa” e la caseina totale, si è riusciti a determinare direttamente, per quasi l’85% delle bovine, gli assetti genici per l’allele B. L’allele alternativo è sempre stato considerato quello A visto che le altre varianti alleliche sono estremamente rare. Riconoscendo l’importanza che le proteine k-caseina, αs1-caseina e ß-lattoglobulina rivestono sulle caratteristiche casearie del latte, si è infine implementato uno studio per creare una procedura di calcolo probabilistico in grado di assegnare, ai soggetti senza analisi per le tre varianti proteiche, il genotipo più probabile utilizzando genotipi noti di soggetti appartenenti alla stessa linea parentale. Così facendo si è riusciti ad incrementare, in modo cospicuo e senza ricorrere ad analisi costose, l’archivio delle tre frazioni proteiche del latte. Tutte queste analisi dimostrano che, operando una selezione mirata su nuovi parametri cardine della qualità casearia del latte, è possibile ottenere animali con una maggiore attitudine alla produzione di latte per la caseificazione e alla produzione di formaggi di qualità. Un altro argomento particolarmente innovativo di questo lavoro riguarda i parametri nutraceutici del latte. L’obiettivo è stato quello di raccogliere informazioni sulle casomorfine prodotte dalla digestione della ß-caseina. Infatti, durante il processo digestivo, dalla degradazione della ß-caseina A1 e B -ma non dalla variante A2- viene prodotta la ß-casomorfina-7 (BCM-7), un peptide di 7 amminoacidi che agisce come potente oppioide nell’organismo umano. Vari studi hanno dimostrato che il Bcm-7 può essere uno dei fattori di rischio per varie malattie umane quali le patologie cardiovascolari, il diabete di tipo 1 e la sindrome di morte improvvisa dei neonati. Si sono verificate, inoltre, le frequenze alleliche della β-caseina nella popolazione di razza Bruna per analizzare come queste siano variate negli anni anche in relazione alla selezione attuata dalla razza per la k-caseina.; The purpose of this research is to identify new milk quality parameters with particular emphasis on its cheese processing aptitude. The research was focused on milk casein because of its strong influence on cheese yield and quality. On casein fractions, particular attention was addressed to k-casein, which is the most interesting and important casein component in that it is centrally involved in the formation and stabilization of casein micelles, in the coagulation of milk by rennet and in many other technologically-important properties of the milk protein system. Since the methods used so far to determine both the genotype and the relative content of k-casein in the sample require the use of sophisticated tools, this research reports the setting up and the validation of a rapid test (an ELISA test called “Test Kappa”) which successfully quantify the content of k-casein B in bulk milk samples. The “Test Kappa” is not expensive, fast and, consequently, compatible with the routine laboratory analyses. The contents of k-casein B in bulk milk of significant number of farms were monitored with “Test Kappa”. The average percentage of k-casein B on total casein shows a wide variability (ranging from 0.10 to 12.56 %) and the analyses demonstrate that this parameter is influenced by genetic factors, such as cattle breed, and not by environmental factors. The k-casein B content affects both curd firming time and curd firmness. Therefore, it was verified that the “k-casein B content” parameter can provide additional information on the processing quality of milk. Tue, 19 Apr 2011 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1578 2011-04-19T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1369 Title: Valorizzazione e qualificazione di prodotti della pesca ed acquacoltura Authors: Olivieri, Vincenzo Abstract: La ricerca ha valutato parametri sensoriali, fisici, chimici e microbiologici di orata (Sparus aurata) durante la conservazione in MAP. Campioni di pesce, ottenuti da 2 allevamenti off-shore situati rispettivamente nel Tirreno Settentrionale e nel Tirreno meridionale, sono stati analizzati dopo 1, 5, 7, 12, 15 e 19 giorni di stoccaggio. La valutazione sensoriale è stata effettuata utilizzando il Quality Index Method (QIM). Le analisi di tipo fisico, chimico e microbiologico sono state eseguite su pools di tessuto muscolare. I risultati mostrano che la shelf-life di orata confezionato in MAP, determinata da valutazione sensoriale, è stata inferiore a 12 giorni. E’ stata riscontrata una relazione tra Qim e parametri fisici, chimici e microbiologici.; The research evaluates sensorial, physical, chemical and microbiological parameters of gilthead sea bream (Sparus aurata) during storage in MAP. Fish samples, obtained from two off-shore breedings located in Northern Tyrrhenian Sea and Southern Tyrrhenian Sea, were analyzed after 1, 5, 7, 12, 15 and 19 days of storage. Sensory assessment was carried out using the Quality Index Method (QIM). Physical, chemical and microbiological assays were performed on muscle pools. The results show that the shelf-life of gilthead sea bream packaged in MAP, as determined by acceptability sensory scores, was lower than 12 days. A relationship between QIM and the physical, chemical and microbiological parameters has been found. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1369 2009-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1366 Title: Marcatori molecolari in vertebrati di interesse zootecnico e conservazionistico Authors: La Fata, Isabella Abstract: In Italia lo studio genetico di popolazioni e specie è ancora carente sotto molti punti di vista, soprattutto per quanto riguarda l’analisi delle popolazioni sottoposte a gestione diretta da parte dell’uomo. Implementare le indagini per tutte le specie che mostrano lacune conoscitive circa i processi microevolutivi che le riguardano può essere una grandissima risorsa e un prezioso strumento per i gestori della fauna. Attraverso l’utilizzo di marcatori mitocondriali e nucleari è stata compiuta un’analisi del livello di differenziazione e dell’origine di popolazioni di alcune specie animali italiane: il capriolo (Capreolus capreolus), la cui importanza per scopi venatori la vede sottoposta a pratiche di ripopolamento e traslocazioni, non sempre in accordo con principi di conservazione; specie di lamprede non parassite italiane (Lampetra planeri e Lethenteron zanandreai) che, per interventi antropici di controllo di fiumi e torrenti, vedono compromessi molti degli areali di riproduzione e, di conseguenza, la riduzione della loro biodiversità; ed infine, la donnola (Mustela nivalis), il cui comportamento fortemente elusivo la rende poco studiata dal punto di vista genetico. 1. ORIGINE ED EVOLUZIONE DI POPOLAZIONI DI CAPRIOLO (Capreolus capreolus L.) DELL’APPENNINO SETTENTRIONALE Lo studio della variabilità mitocondriale (D-Loop) e della variabilità nucleare, attraverso marcatori RAPD e marcatori STR, di individui di capriolo ha permesso di esaminare la struttura genetica e di ipotizzare l’origine delle popolazioni attuali di Parma e delle province limitrofe (Reggio Emilia e Piacenza). L’acquisizione di dati genetici di popolazioni toscane, per alcune delle quali si suppone esista ancora un certo grado autoctonia, ha consentito di formulare stime della loro influenza sulla composizione degli attuali popolamenti transappenninici. Un’accurata documentazione bibliografica dalle principali fonti storiche, contenenti informazioni riguardo a ripopolamenti di capriolo in Italia nei decenni passati, ha confermato operazioni di reimmissione e traslocazione a partire dal secondo dopoguerra e ha messo in luce come episodi di traslocazione si verifichino ancora oggi a partire da popolazioni sviluppatesi da nuclei di individui provenienti da popolazioni slovene, croate, austriache, olandesi. L’analisi della variabilità mitocondriale è stata effettuata tramite sequenziamento diretto della regione di controllo (D-loop) e allineamento delle sequenze ottenute con altre presenti in banca dati per la costruzione di alberi filogenetici e Median-joining Network oppure tramite SSCP (Single-Strand Conformational Polymorphism) della prima regione ipervariabile della D-loop in 112 campioni provenienti da Parma, Piacenza, Reggio Emilia, Bologna, e da diverse province della Toscana. I risultati ottenuti mostrano che il 28% degli individui analizzati presenta aplotipi di popolazioni dell’Europa Centrale ed Orientale, mentre il 72% presenta aplotipi descritti in popolazioni della sottospecie Capreolus capreolus italicus. Anche i marcatori RAPD riflettono e confermano, parzialmente, la suddivisione tra i due aplotipi a livello nucleare. I marcatori STR supportano una moderata diversificazione tra popolazioni geografiche se si considerano a coppie, ma con una chiara evidenza di flusso genico in atto tra esse. I dati suggeriscono che l’attuale popolamento del territorio parmense e reggiano potrebbe derivare non solo da immissioni di individui alloctoni dalle Alpi e dall’Europa Orientale, ma anche da un apporto genetico di relitti autoctoni e da migranti dalla Toscana settentrionale. Il popolamento piacentino, a sua volta, raggruppa caratteristiche aplotipiche della popolazione ligure, storicamente reintrodotta con individui provenienti dall’Est Europa, ma anche di aplotipi riconducibili al clade italico, verosimilmente in espansione dalla provincia di Parma. 2. CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI LAMPREDE DI BACINI TIRRENICI E ADRIATICO DELL’ ITALIA CENTRALE Gli scopi del lavoro sono stati principalmente quelli di valutare la somiglianza genetica di popolazioni di Lampetra planeri residenti in bacini differenti (Adriatico e Tirreno) e verificare alcune ipotesi sull’origine della popolazione adriatica; inoltre, vista la difficoltà di identificazione delle specie Lampetra planeri, Petromyzon marinus e Lethenteron zanandreai, soprattutto a livello larvale, si è proceduto all’identificazione di marcatori molecolari utili per la diagnosi delle stesse, indipendentemente dallo stadio di sviluppo dei soggetti da classificare. A tal fine sono state eseguite la caratterizzazione aplotipica di tutti gli individui campionati, condotta attraverso l’analisi di sequenze parziali dei geni mitocondriali citocromo ossidasi I (COI) e citocromo B (Cyt b) (Barcoding molecolare), la costruzione di alberi filogenetici con metodi basati su distanze genetiche, l’analisi sperimentale del gene mitocondriale COI con RFLP e l’analisi multilocus con la tecnica RAPD tramite otto primer decanucleotidici. I risultati ottenuti hanno confermato la presenza di un unico aplotipo mitocondriale caratteristico di tutti i soggetti di L. planeri analizzati, che depone a favore di un recente isolamento riproduttivo non più sostenuto da specie sorelle migratrici. Inoltre, i marcatori RAPD indicano una modesta variabilità tra le popolazioni che può essere spiegata attraverso fenomeni di isolamento per distanza, supportato dalla scarsa vagilità degli individui della specie. È stato dimostrato, infine, che l’analisi dei polimorfismi di restrizione ottenuti impiegando amplificati del gene COI consente una rapida ed economica discriminazione delle specie, proponendosi, quindi, come valido strumento per migliorare le possibilità d’intervento a fini conservazionistici. 3. CARATTERIZZAZIONE APLOTIPICA DI DONNOLE (Mustela nivalis L.) ITALIANE L’obiettivo di tale studio era verificare le possibili origini biogeografiche e la strutturazione dell’attuale popolamento italiano ed insulare. A causa della grande variabilità che caratterizza la specie, della vastità dell’areale occupato e dell’incertezza riguardo alla collocazione dei rifugi glaciali pleistocenici, la sistematica e la filogeografia della donnola risultano ancora piuttosto incerte. Inoltre, la sua attuale presenza in alcune isole del Mediterraneo, quali la Sardegna, potrebbe essere spiegata attraverso introduzioni effettuate dall’uomo a partire dall’Età del Bronzo, piuttosto che con colonizzazioni avvenute durante le fasi di regressione marina nei periodi glaciali, come testimonia l’assenza di fossili pre-pleistocenici e pleistocenici in questi luoghi. Il lavoro svolto è consistito nel sequenziamento delle prime 550 basi della regione 5’ della D-loop di individui di provenienza geografica diversa (comprese Sardegna e Corsica), seguito dal confronto delle sequenze sperimentali con sequenze disponibili in banca dati (GenBank) e dalla costruzione di alberi filogenetici e Median-joining Network. L’esito delle analisi condotte conferma la presenza, in Italia, di due linee filetiche conformi sia con un’espansione da un ipotetico rifugio glaciale collocato nel sud-ovest dell’Europa, sia con una colonizzazione più tardiva a partire dall’Europa Orientale, probabilmente supportata dall’intervento umano. È confermata, inoltre, l’eventualità di una colonizzazione della Corsica a partire da animali italiani, mentre la popolazione sarda appare essere decisamente più eterogenea, con contributi riconducibili ad aplogruppi mitocondriali tipici di regioni europee e mediterranee diverse. Per quanto riguarda il popolamento sardo di M. nivalis, pertanto, non è possibile avanzare l’ipotesi di una colonizzazione univoca, né dal punto di vista geografico e nemmeno da quello temporale.; In Italy the genetic studies of population and species are still inadequate, especially those related to the management of wildlife. It is particularly important to carry out surveys on microevolutionary processes of manageable populations because this knowledge could be a valid tool for wildlife management. In this study we have used mitochondrial and nuclear markers to investigate the degree of differentiation and the origin of populations of three Italian animal species: the roe deer (Capreolus capreolus), a game species that has been restocked and translocated without following conservational principles; the non-parasitic Italian lampreys (Lampetra planeri and Lethenteron zanandreai), which show a decrease of their genetic diversity due to habitat loss caused by river habitat perturbation; the weasel (Mustela nivalis), which shows an elusive behaviour and is poorly studied from a biomolecular point of view. 1. ORIGIN AND EVOLUTION OF ROE DEER POPULATIONS (Capreolus capreolus L.) OF NORTHERN APENNINES We studied mitochondrial (D-loop) and nuclear (RAPD and STR markers) variability in roe deer, in order to evaluate genetic structure and origin of Parma, Reggio Emilia and Piacenza roe deer populations. Moreover, we compared these informations with genetic data of Tuscan populations, some of which are considered to be autochthonous, in order to evaluate their influence on the composition of the current populations of Emilia. We carried out an accurate bibliographical documentation from the principal historical sources, containing informations about translocations of roe deer in Italy in the past decades. It confirmed the existence of not well documented operations which started from the beginning of the Second World War. Moreover, we found the existance of current translocations with individuals of populations arising from allochthonous individuals of Slovenia, Croatia, Austria, Holland. To test the mitochondrial variability, we sequenced the control region (D-loop) or carried out SSCP (Single-Strand Conformational Polymorphism) of the first hypervariable region of D-loop in 112 samples coming from Parma, Piacenza, Reggio Emilia, Bologna and many Tuscan provinces. The results highlight that 28% of individuals have mitochondrial haplotypes of Central and Eastern European populations, while 72% of individuals have mitochondrial haplotypes of Capreolus capreolus italicus subspecies. RAPD markers partially confirm this haplotypic subdivision, while STR markers show a moderate differentiation among geographic populations, even if a gene flow among them is evident. These data suggest that current populations of Parma and Reggio Emilia originate not only from allochthonous individuals coming from Alps and Oriental Europe, but also from a genetic contribution of autochtonous relics and from migrants from northern Tuscany. The population of Piacenza, shows an haplotypic contribution of the ligurian population, reintroduced in the past with individuals coming from Eastern Europe, but also haplotypes of individuals belonging to the italicus clade, most likely in expansion from the Parma province. 2. MOLECULAR CHARACTERIZATION OF LAMPREYS OF TYRRHENIAN AND ADRIATIC BASINS OF CENTRAL ITALY This work appraised the genetic similarity of populations of Lampetra planeri of different (Adriatic and Tyrrhenian) basins and verified some hypotheses on the origin of the adriatic population. Moreover, because of the difficulty of identification of Lampetra planeri, Petromyzon marinus and Lethenteron zanandreai, especially to a larval level, we identified useful molecular markers for their classification. The haplotypic characterization of sampled individuals was performed by analysing partial sequences of mitochondrial genes COI and Cyt b; then we carried out the experimental analysis of mitochondrial gene COI by means of RFLP analysis and a multilocus analysis with RAPD markers by means of eight decanucleotidic primers. The results confirmed the presence of only one mitochondrial haplotype for every subject of L. planeri analyzed, giving a real evidence for a recent reproductive isolation not sustained by migratory sisters species. Moreover, RAPD markers point out a limited variability among the populations, which can be explained with the isolation by distance, supported by individuals scarce vagility. Finally, we showed that RFLP analysis of COI gene allows a rapid and economic discrimination of the species and, for this reason, it can be a valid tool in a management with conservation purposes. 3. MITOCHONDRIAL CHARACTERIZATION OF ITALIAN WEASELS (Mustela nivalis L.) The study aimed to verify the possible biogeographic origin and structure of the current continental and insular populations of Italian weasels. The systematic and phylogeography of weasels are still rather uncertain because of the great variability of the species, the vastness of its distribution area and the uncertainty of its glacial refugia of Pleistocene. Moreover, its actual presence in some Mediterranean islands, as Sardinia, could be more explained with human introductions since the Bronze age, rather than with natural colonisations in the glacial periods, as testified by the absence of pleistocenic fossils in these places. We firstly sequenced the first 550 bases of the 5' region of the D-loop of individuals of different geographical origins (Sardinia and Corsica included). Than we compared the experimental sequences available in GenBank and finally we built phylogenetic trees and Median-joining Network. The results confirm the presence of two phyletic lines in Italy. The first one could reflect an expansion from a hypothetical glacial refugium situated in the Southwestern Europe; the second one could reveal colonisations from Oriental Europe, probably supported by human intervention. Thus, the colonization of Corsica actually began from Italian animals, whereas the Sardinian population appears to be more heterogeneous, with mitochondrial haplotypes typical of different European and Mediterranean regions. It is still not possible, therefore, to advance the hypothesis of an univocal temporal or geographical colonization of the Sardinia. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1366 2009-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1338 Title: Caratterizzazione Biofisica di Odorant Binding Proteins da Vertebrato e Possibili Applicazioni Biotecnologiche Authors: Crescenzo, Roberta Abstract: The Binding Protein family is a class of proteins characterized of a ligand binding site able to bind different probes of biological nature. For this reason it appears that these biomolecules are currently studied in several labs around the world since they also represent excellent candidates in designing of specific optical biosensors for detection of small analytes. Odorant Binding Proteins (OBPs), a sub-class of lipocalins, are defined by their property of reversibly binding volatile chemicals called “odorants”. Odorants and pheromones are important signals conditioning the behaviour of animals. These soluble proteins of low molecular mass, synthesized in the lateral nasal glands and secreted into the nasal mucosa, seem to play important roles in chemical communication [Pelosi P., Ann. N. Y.Acad. Sci., 1998]. They are present at high concentrations in biological fluids, involved in the perception and in the delivery of chemical messages of pheromonal significance. This class of proteins have been isolated from such as cow, rabbit, pig and mouse. Vertebrates' OBPs share a typical β-barrel folding and an hydrophobic binding pocket for ligands [Bianchet M.A., et al., Nat. Struct. Biol. 1996; Tegoni M., et al., Nat Struct Biol, 1996]. The subject of this PhD project is the structural and functional characterization of the eukaryotic Odorant Binding Proteins (OBPs) originally characterized from bovine and pig nasal mucosa. The work was based on recombinant OBPs obtained upon gene cloning in E. coli and protein expression and purification procedures. The main aim of the work was to perform a structural characterization of the OBPs by optical spectroscopy in order to investigate the stability and the conformational dynamics of these biomolecules. OBPs also represent an interesting and simple model for studying the phenomena of protein aggregation and how the formation of protein dimers and/or protein oligomers is depending upon single amino acid mutations in protein primary structure. In addition, the project is aimed at acquiring basic knowledge on the structure and stability of proteins and at developing biotechnological applications such as the design of innovative optical OBP-based biosensors for the detection of small molecules. As a consequence, it is of interest to study the factors regulating the stability of these proteins, and to establish general guidelines that allow to address a large variety of different questions in biosensing applications. To this end, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence anisotropy measurements and ultracentrifugation (AUC) experiments were carried out to gain information on the thermodynamic parameters related to OBPs stability. The obtained results show that OBPs are good candidates as probe for specific optical biosensors for sensing small analytes. They also suggest their potential use as a biological scaffold for a variety of biotechnological applications. In fact, in the frame of this thesis project two different biosensor prototypes were realized: a) fluorescence-based biosensor; b) surface acoustic wave-based biosensor. In particular the fluorescence biosensors was realized by immobilizing the OBP onto carbon nano-tubes. The binding of the ligand, 1-octen-3-ol (OCT) to the immobilized OBP was detected following the efficiency of the process resonance energy transfer (RET) between intrinsic tryptophan residues of OBP and an energy acceptor 1-amino-anthracene (AMA) that fits in the OBP funnel. As regard the SAW-based biosensor, OBP were immobilized onto a wafer realized by deposition of 5 nm gold film on a 100 nm aluminum film and mounted on a TO39 package. Both, fluorescence biosensors and surface acoustic wave (SAW) biosensors are currently being used in medicine, environment monitoring, biotechnology, food industry and security applications Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1338 2009-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1134 Title: Caratterizzazione biochimica, biofisica e strutturale di proteine di batteriofagi infettanti Lactococcus lactis coinvolte in meccanismi di Ricombinazione Omologa e Infezione Abortiva Antivirale Authors: Scaltriti, Erika Abstract: I batteriofagi virulenti del gruppo 936 e P335 sono predominanti nelle infezioni verso Lactococcus lactis, un batterio Gram-positivo molto diffuso nell’industria casearia. Tra i meccanismi adottati dal batterio contro l’infezione virale, ritroviamo i meccanismi abortivi antivirali (Abi), di cui poco si conosce riguardo alla loro modalità d’azione. Sotto la pressione selettiva dei sistemi Abi, la ricombinazione omologa con sequenze presenti nel cromosoma batterico (Bouchard et al 2000 et 2002, Moineau et al 1995) produce fagi mutati che sono stati ritrovati in fermentazioni ad esito negativo e perciò recanti enormi perdite economiche. Riguardo il sistema AbiK, Bouchard et al (Bouchard et al 2004) hanno identificato quattro proteine denominate Sak, a bassa similarità di sequenza, ma tutte implicate nella sensibilità verso AbiK. Tra queste proteine, Ploquin et al (Ploquin et al 2008) hanno dimostrato che la ORF252 del fago ul36 (specie P335), denominata Sak, é una “DNA Single Strand Annealing Protein (SSAP)“, omologa della proteina eucariotica RAD52. Sak3 del fago p2 (specie 936) é invece la proteina di riferimento del terzo gruppo di geni sak che non mostrano alcuna similarità di sequenza con le SSAPs. Indipendentemente da questo, le proteine Sak sono sicuramente coinvolte nel meccanismo di ricombinazione omologa poiché i loro geni sono localizzati in « recombination cassette » insieme a geni di altre proteine chiaramente implicate in questi meccanismi (Bouchard and Moineau, 2004). La prima parte dei nostri studi é stata focalizzata sulla caratterizzazione biochimica e strutturale delle due proteine Sak : Sak del fago UL36 e Sak3 del fago p2. Di queste ultime abbiamo studiato lo stato di oligomerizzazione attraverso un approccio multi-tecnica, abbiamo visualizzato le tipiche strutture ad anello (Cryo Microscopie Electronique) ed allestito test funzionali per chiarire la loro appartenenza alla famiglia delle SSAP. La loro capacità di legare il DNA é stata inoltre testata e studiata attraverso « Electrophoretic Mobility Shift Assays, EMSA », Microscopia a Forza Atomica (AFM) e « Surface Plasmon Resonance, SPR » ; la relazione con altri partners nel processo di ricombinazione omologa é stata inoltre testata tramite SPR. Nella seconda parte del nostro studio, abbiamo caratterizzato la “Single-Strand Binding protein (SSB)” del fago p2, partner di Sak3 nella ricombinazione omologa. A questo proposito sono stati studiati il livello di espressione di SSB durante l’infezione fagica, la sua capacità di legare il DNA a singolo filamento, le sue implicazioni nel meccanismo di ricombinazione omologa ed abbiamo determinato la sua struttura tridimensionale. I nostri risultati costituiscono gli elementi che permetteranno la comprensione di alcune funzioni sconosciute delle proteine Sak, in particolare del legame tra gli avvenimenti del processamento del DNA ed il sistema AbiK, dell’implicazione di altre proteine correlate come le SSBs in questi meccanismi.; Virulent phages of the 936 and P335 group are predominant in infections to Lactococcus lactis, a Gram-positive bacterium widely used in the dairy industry. Among the mechanisms adopted by the bacterium against virus infection, abortive infection mechanisms (Abi) were found, but little is known about their molecular way of action. Under the selective pressure of Abi systems, homologous recombination with phage-related sequences present in the host chromosome (Bouchard et al 2000 and 2002, Moineau et al 1995) produces phage mutants which are found in unsuccessful fermentations that lead to huge economical looses. In particular for the AbiK system, Bouchard et al (Bouchard et al 2004) have identified four non similar proteins involved in the sensibility to AbiK named Sak. Among these proteins, Ploquin et al (Ploquin et al 2008) demonstrated that ORF252 of phage ul36 (species P335), renamed Sak, is a DNA Single-Strand Annealing Protein (SSAP), homologue of the eukaryotic protein RAD52. Sak3 from phage p2 (species 936) is reported to be the reference for the third group of identified sak genes that do not show significant sequence similatity to SSAPs. However, Sak proteins were suspected to be involved in homologous recombination due to their genetic localization in “recombination cassette” with other genes of proteins clearly involved in these processes (Bouchard and Moineau, 2004).The first part of our studies present the biochemical and structural characterization of two Sak proteins: the Sak of phage UL36 and the Sak3 of phage p2. In particular, multi-technique approaches were performed to investigate the oligomerization state and to visualise ring structures (Cryo Electron Microscopy), while functional tests were used to elucidate the SSAP family membership. DNA binding properties were also tested by gel mobility shift assays (EMSA), atomic force microscopy (AFM) and surface plasmon resonance (SPR), and the relationship with their partners in homologous recombination was determined. In the second part of our studies the phage p2 single-strand binding protein (SSB), a Sak3 partner in homologous recombination/replication, was studied. Expression level during phage infection, binding properties to ssDNA, involvement in homologous recombination processes and tridimensional structure were elucidated. Our studies might complete and help to understand some aspects of the Sak function leading to the definition of a linkage between DNA processing events and the antiviral system AbiK, and might elucidate the implication of correlated recombinant proteins like SSBs in these processes. Tue, 29 Sep 2009 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1134 2009-09-29T22:00:00Z