http://hdl.handle.net/1889/664 Tue, 18 Jun 2013 21:17:00 GMT 2013-06-18T21:17:00Z http://hdl.handle.net/1889/1933 Title: Metodi molecolari per la diagnosi di laboratorio e lo studio epidemiologico delle infezioni da Giardia intestinalis, Cryptosporidium spp. e Dientamoeba fragilis Authors: Montecchini, Sara Abstract: Le malattie gastrointestinali sostenute da protozoi patogeni a trasmissione fecale-orale hanno un rilevante impatto in termini di morbilità e mortalità in tutto il mondo, con prevalenza particolarmente elevata nei Paesi in via di sviluppo. Tuttavia, tali infezioni sono diventate un problema non trascurabile per i Paesi industrializzati quali il nostro, in relazione al progressivo e costante aumento di soggetti che per ragioni diverse (turismo, lavoro, opere missionarie, etc.) si recano in aree iperendemiche e ai flussi migratori provenienti dalle stesse, oltre che all’adozione. Il nostro laboratorio infatti riceve numerosi campioni di questi soggetti e di italiani apparentemente privi di fattori di rischio, per i quali non è possibile escludere casi autoctoni di infezione. Tra i protozoi più frequentemente implicati nelle parassitosi intestinali, oltre all’ameba Entamoeba histolytica agente di amebiasi intestinale e viscerale, vi sono due protozoi riconosciuti come agenti di gastroenterite, G. intestinalis e Cryptosporidium spp., e D. fragilis, protozoo a prevalenza crescente nei Paesi industrializzati con ruolo patogeno inizialmente controverso ma ormai chiarito. La diagnosi di parassitosi intestinale, che prevede indagini convenzionali basate sull’analisi di caratteristiche morfo-strutturali e comprendenti l’esame microscopico, la coltura per protozoi ed elminti e la ricerca di antigeni, presenta limiti dovuti alla necessità di personale addestrato e alle difficoltà intrinseche dell’esame parassitologico legate prevalentemente alla scarsa sensibilità e/o specificità dei singoli metodi. Recentemente sono stati sviluppati e proposti diversi saggi di PCR, convenzionale e/o real-time, per la diagnosi di parassitosi intestinale, volti al superamento di tali limiti. Nel nostro laboratorio, dove è da tempo in atto un progetto di ricerca applicato alla diagnostica innovativa delle parassitosi e, in particolare, di quelle intestinali, è già stato sviluppato ed estesamente valutato un saggio molecolare per la diagnosi di amebiasi, con conseguente vantaggiosa applicazione nella pratica diagnostica quotidiana. In questo campo di ricerca applicata si inserisce lo scopo di questo studio che si propone di valutare 3 saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente, finalizzato alla potenziale applicazione nella pratica diagnostica quotidiana e alla definizione della reale prevalenza dei 3 protozoi nella realtà considerata, che si ipotizza sottostimata in quanto influenzata dai limiti della diagnosi mediante metodi convenzionali. I saggi di real-time PCR, aventi come bersaglio i geni codificanti per l’RNA ribosomiale dei 3 protozoi, sono stati valutati utilizzando campioni di feci appartenenti a pazienti con sospetta parassitosi intestinale inviati presso il nostro laboratorio, a confronto con i risultati ottenuti mediante metodi convenzionali di diagnosi parassitologica, quali l’esame microscopico diretto e previo arricchimento, la ricerca degli antigeni specifici di G. intestinalis e Cryptosporidium spp. mediante saggio immunocromatografico e reazione di immunofluorescenza e la coltura per protozoi per quanto riguarda la ricerca di D. fragilis. I campioni utilizzati per la valutazione dei saggi molecolari erano complessivamente 2770 di 1410 pazienti nel periodo 2006-2010. In particolare, sono stati analizzati 771 campioni di 386 pazienti inviati dal 2006 al 2008, 1040 campioni di 533 pazienti inviati dal 2006 al 2010, 959 campioni di 491 pazienti inviati dal 2006 ad Aprile del 2009, per la valutazione dei saggi per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente. Da un punto di vista analitico i 3 saggi di real-time PCR valutati si sono rivelati altamente sensibili e specifici dimostrando un limite di rivelazione corrispondente ad un ridotto numero di stadi diagnostici (cisti di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., trofozoiti di D. fragilis) nel campione di feci e assenza di reattività crociata con il DNA di altri parassiti. I saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis valutati in questo studio si sono dimostrati altamente sensibili e specifici, non solo da un punto di vista analitico ma anche da un punto di vista diagnostico, in quanto oltre a confermare i casi diagnosticati mediante metodi convenzionali hanno rilevato casi aggiuntivi; in particolare hanno rispettivamente permesso di diagnosticare 13 casi aggiuntivi di giardiasi su un totale di 106, 1 caso aggiuntivo di criptosporidiosi su un totale di 13, 60 casi aggiuntivi di dientamoebiasi su un totale di 105. I dati ottenuti dalla valutazione hanno inoltre permesso di delineare la reale prevalenza di G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, identificandoli come i 3 protozoi patogeni più frequenti tra i pazienti con sospetta parassitosi intestinale nella nostra realtà. Il saggio di real-time PCR per la diagnosi di infezione da D. fragilis, in particolare, si è dimostrato di grande utilità ed adeguato per l’applicazione alla pratica diagnostica quotidiana, in quanto quasi il 60% dei casi è stato rilevato mediante il solo saggio molecolare. Di particolare interesse è il risultato ottenuto relativamente al sequenziamento dei campioni positivi per D. fragilis, tra i quali 5 campioni presentavano una sequenza potenzialmente attribuibile al genotipo 2 ad oggi riconosciuto in soli 2 isolati al mondo. La rarità del genotipo 2 e i risultati ottenuti nel presente studio aprono la base a futuri studi mirati alla determinazione di eventuali differenze nelle modalità di trasmissione e nelle manifestazioni cliniche, tra i due genotipi noti. I saggi di real-time PCR per la ricerca del DNA di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., invece, non si sono rivelati nella nostra esperienza sufficientemente vantaggiosi rispetto ai metodi convenzionali; pertanto la loro applicazione in diagnostica potrebbe essere utile in futuro solo se inclusi in una reazione di tipo multiplex, con conseguenti vantaggi in termini di costo e di minore complessità dell’allestimento. È stata inoltre compiuta la genotipizzazione dei ceppi di G. intestinalis identificati in questo studio, volta all’identificazione dei genotipi A e B, gli unici riscontrabili nell’uomo, eseguita attraverso l’analisi del polimorfismo nella lunghezza dei frammenti di restrizione del gene codificante per la proteina β-giardina del protozoo. La genotipizzazione di G. intestinalis ha mostrato un risultato compatibile con i dati europei ma in contrasto con i dati italiani, rivelando una maggiore prevalenza del genotipo B (66,2%) rispetto al genotipo A (33,8%), sebbene non sia stato possibile genotipizzare una parte dei campioni, probabilmente a causa del fatto che il bersaglio di amplificazione è presente in singola copia nel genoma del protozoo e/o di potenziali “mismatches” nelle sequenze complementari ai primer. In futuro eseguendo la genotipizzazione basandosi sull’analisi dei polimorfismi di diversi geni contemporaneamente potranno essere completati gli studi di genotipizzazione del protozoo chiarendo le differenze al momento osservate tra i nostri dati in accordo con quelli europei e i dati di altri studi italiani. I risultati di questo studio hanno messo a disposizione saggi pronti all’applicazione in diagnostica e dati importanti relativi all’epidemiologia delle infezioni da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis ed infine hanno contribuito ad estendere conoscenze sulla distribuzione nella nostra realtà dei genotipi di G. intestinalis e di D. fragilis che infettano l’uomo.; Gastrointestinal diseases due to pathogenic protozoa are nowadays a significant cause of morbidity and mortality worldwide, especially in developing countries. Nevertheless these infections are now an important problem in industrialised countries, such as Italy, related to a continuous and constant increase in subjects travelling to hyperendemic areas for different reasons (tourism, work, mission, ecc.), to migratory flows from the same areas, and to adoption. Our laboratory, in fact, receives a lot of samples belonging to such subjects and to Italians apparently without risk factors, for which autochthonous cases of infections could not be excluded. In the group of protozoa most frequently involved in intestinal parasitoses, besides the amoeba causing intestinal and visceral amoebiasis Entamoeba histolytica, are included Giardia intestinalis and Cryptosporidium spp., two protozoa known as gastroenteritis agents, and Dientamoeba fragilis, a protozoan with an increasing prevalence in developed countries and with a pathogenic role debated for a long time and nowadays recognized. The diagnosis of intestinal parasitosis that is founded on conventional assays based on the analysis of morphological and structural features and including microscopic examination, protozoa and helmints culture, and antigen detection, is affected by limits due to the requirements of well-trained personnel and to the intrinsic difficult of parasitologic examination, mostly based on the low sensitivity and/or specificity of conventional methods. Recently, in order to circumvent these limits, different PCR assays, both conventional and real-time, were developed for the diagnosis of intestinal parasitoses. In our laboratory, where a research project applied to the innovative diagnosis of parasitoses in particular intestinal parasitoses is under way, a molecular assay for the diagnosis of amoebiasis was already developed and widely evaluated with a subsequent and advantageous application to the daily diagnostic practice. The scope of this study is included in this applied research field since it aimed to the evaluation of 3 real-time PCR assays for the diagnosis of infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis, respectively, finalized to the application to the diagnostic practice and to the definition of the actual prevalence of the cited protozoa in our area, hypothetically underestimated due to the limits of the diagnosis by conventional methods. The real-time PCR assays, targeting the rRNA genes of the 3 protozoa, were evaluated by using faecal samples belonging to patients with the suspicion of intestinal parasitosis sent to our laboratory, as compared to conventional methods of diagnosis, such as microscopic examination of fresh and concentrated faeces, detection of specific antigen of G. intestinalis and Cryptosporidium spp. by immunocromatographic assay and direct immunofluorescence, and protozoa cultivation as concerns D. fragilis detection. The samples used for the evaluation of the real-time PCR assays were totally 2770 of 1410 patients in the period 2006-2010. In particular, 771 samples of 386 patients sent from 2006 to 2008, 1040 samples of 533 patients sent from 2006 to 2010, 959 samples of 491 patients sent from 2006 to April 2009, were analysed for the diagnosis of infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis, respectively. From an analytic point of view, the evaluated real-time PCR assays proved to be highly sensitive and specific demonstrating a detection limit corresponding to a low number of parasitic diagnostic stages (G. intestinalis and Cryptosporidium spp. cysts, D. fragilis trophozoites) in faecal specimens and absence of cross-reactivity with the DNA of other parasites. The real-time PCR assays for the diagnosis of infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis evaluated in this study proved to be highly sensitive and specific also from a diagnostic point of view, since, besides confirming of cases already diagnosed by conventional methods, they were able to reveal additional cases: in particular, 13 cases of giardiasis on a total of 106 cases, 1 case of cryptosporidiosis on a total of 13 cases, 60 cases of dientamoebiasis on a total of 105 cases, were respectively diagnosed by molecular methods. Data obtained by the evaluation of these assays gave a contribution to determining the actual prevalence of G. intestinalis, Cryptosporidium spp. and D. fragilis, identifying them as the three most frequent protozoa among patients suspected of having intestinal parasitosis in our setting. In particular, the real-time PCR assay for the diagnosis of infection by D. fragilis, demonstrated to be very useful and adequate to the application in the daily diagnostic practice since almost 60% of cases were revealed only by it. The sequencing of D. fragilis positive samples was of interest showing 5 samples with a sequence probably assignable to the genotype 2, at the present time recognized only in 2 isolates in the world. The rarity of the genotype 2 and the results obtained in the present study are the basis for future studies for the determination of differences between the two exsistent genotypes in the way of transmission and in clinical manifestations. On the contrary, the real-time PCR assays for the diagnosis of infection by G. intestinalis and Cryptosporidium spp. did not offer sufficient advantages as compared to the conventional methods and their application could be taken into account in the future only if included in a multiplex PCR approach, with consequent advantages being less expensive and cumbersome to perform. Furthermore, in this study a genotyping for the identification of the genotypes A and B of G. intestinalis, the only two found in human strains, was performed by restriction fragment length polymorphism analysis of the β-giardin gene, on samples positive by real-time PCR. G. intestinalis genotyping revealed a result consistant with European data but in contrast with Italian ones revealing an higher prevalence of genotype B (66,2%) as compared to that of genotype A (33,8%) although it was not possible to type a portion of samples, maybe due to the fact that the genotyping PCR target was present in single copy in the protozoan genome and/or to mismatches likely occurring in the sequences complementary to primers. In the future, if the genotyping will be performed by polymorphisms analysis of different genes simultaneously, the typing of G. intestinalis will be completed in order to understand the differences between our data, according to the European ones and to data of other Italian studies. The results of this study offered assays ready-to-use in the diagnostic practice and important data as concerns to the epidemiology of the infections by G. intestinalis, Cryptosporidium spp., and D. fragilis, and, finally gave a contribution to broading the knowledges on the distribution in our setting of genotypes of G. intestinalis and D. fragilis infecting humans. Sat, 31 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1933 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1932 Title: Possibili meccanismi di risposta cellulare all'infezione litica da citomegalovirus umano in un modello simil-macrofagico in vitro Authors: Germini, Diego Abstract: In corso di infezione da citomegalovirus umano (HCMV), un adatto stato metabolico della cellula è fondamentale per garantire al virus di portare a termine una efficace infezione produttiva. Per questo motivo HCMV ha sviluppato diverse strategie per alterare il metabolismo della cellula ospite al fine di creare le condizioni più favorevoli per la propria replicazione. In particolare, è nota la capacità del virus di interferire con il ciclo cellulare, provocandone generalmente il blocco in G1-G1/S in cellule proliferanti. Le finalità principali di questo studio sono state quelle di valutare la possibile azione di interferenza sul ciclo cellulare da parte di HCMV ed i possibili meccanismi che ne sono alla base in cellule irreversibilmente uscite dal ciclo cellulare. A tale scopo, sono stati utilizzati monociti THP-1 differenziati a macrofagi; anche in questo caso è stata dimostrata un’azione di interferenza da parte di HCMV sul ciclo cellulare, che si estrinseca spingendo tali cellule, inizialmente ferme in G0, verso la fase S. Per quel che riguarda i possibili meccanismi utilizzati dal virus, la parallela osservazione dell’attivazione del “Toll-like receptor” (TLR) 4 in corso di infezione virale e i dati recenti di letteratura che supportano il suo ruolo nell’indurre la proliferazione cellulare, hanno successivamente orientato lo studio alla verifica di un coinvolgimento di questo recettore nel mediare l’azione virus-indotta sul ciclo cellulare. A tale scopo, sono stati utilizzati due specifici antagonisti di TLR4 (che intervengono su due differenti fasi del “pathway” metabolico da esso attivato) per studiare l’efficienza dell’infezione virale e l’effetto di interferenza virus-indotta sul ciclo cellulare. I dati ricavati da questo studio supportano l’ipotesi di un coinvolgimento di TLR4 quale possibile meccanismo cooptato dal virus per l’espletamento di un’efficiente ciclo replicativo litico in macrofagi THP-1.; A suitable metabolic state of the cell is fundamental for a productive infection with human cytomegalovirus (HCMV). In particular, it is known that this virus is able to interfere with the cell cycle regulation, principally by inducing a blockade of proliferating cells in G1-G1/S phases. This study aimed at deepening our knowledge on the HCMV ability to develop a lytic cycle in a cellular model irreversibly withdrawn from the cell cycle and on the possible mechanisms used by the virus to accomplish a successful replication. To this end, we used THP-1 monocytes differentiated to macrophages and demonstrated that, in this case too, HCMV is able to deregulate the cell cycle, pushing these cells, arrested in G0, towards the S phase. As to the possible mechanisms underlying these observations, the parallel results demonstrating the Toll-like receptor (TLR) 4 activation following HCMV infection of THP-1 macrophages, and the literature data describing TLR4 as involved in the cell cycle deregulation, let us investigate the possible involvement of TLR4 in the cell cycle alteration observed in HCMV-infected THP-1 macrophages. To this end, two specific TLR4 antagonists (acting on different steps of the metabolic pathway activated by this receptor) were used. Their effects were evaluated by checking the effectiveness of virus infection, as well as the virus-induced activation of the cell cycle. Our data support the notion of a role of TLR4 in favouring the development of an efficient viral lytic cycle in THP-1 macrophages. Wed, 29 Feb 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1932 2012-02-29T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1591 Title: Aspetti funzionali della compartimentalizzazione nucleare di proteine di citomegalovirus umano in un modello di infezione litica in vitro Authors: Rodighiero, Isabella Abstract: Il nucleolo è un dominio nucleare coinvolto nella biogenesi dei ribosomi, così come in molte importanti attività regolatorie cellulari, tra cui il controllo del ciclo cellulare e i processi di maturazione e trasporto di mRNA. Inoltre, numerosi dati di letteratura descrivono un coinvolgimento del compartimento nucleolare durante il ciclo replicativo di molti agenti virali, tra cui i virus erpetici. Precedenti studi svolti dal nostro gruppo di ricerca su citomegalovirus umano (HCMV), hanno dimostrato l’accumulo preferenziale a livello nucleolare (in particolare, anche a livello della matrice nucleolare) di una delle maggiori fosfoproteine (pp65) del tegumento virale nel modello sperimentale costituito da fibroblasti umani infettati liticamente; tale effetto era già evidente a tempi molto precoci dopo l’infezione. Il progetto di ricerca sviluppato e descritto in questa tesi sperimentale è stato rivolto alla valutazione delle possibili implicazioni funzionali (con particolare riferimento all’espletamento del programma di espressione litica virale) della localizzazione nucleolare della proteina pp65 di HCMV. Uno degli strumenti inizialmente impiegati per tale verifica è stato l’utilizzo di sostanze, quali actinomicina D e cisplatino, di cui è nota, qualora utilizzate a basse concentrazioni, una selettiva azione inibitoria sull’enzima RNA polimerasi I (lasciando invece inalterata l’attività di RNA polimerasi II e III) e, conseguentemente, sulla sintesi di RNA ribosomiale. In tali condizioni sperimentali è stata osservata una significativa ridistribuzione delle proteine nucleolari dal nucleolo al nucleoplasma ed una simultanea deplezione della proteina virale pp65 dal compartimento nucleolare; questo effetto era altamente evidente sia in monostrati di fibroblasti trattati per l’estrazione della matrice nucleare in situ, sia in cellule non trattate. In concomitanza a tali effetti, relativi alla deplezione nucleolare di pp65 ed all’inibizione dell’attività dell’enzima RNA polimerasi I, è stata di significativo interesse l’osservazione di un netto ritardo nell’avvio del programma litico di espressione genica virale. Questi risultati suggeriscono una possibile relazione tra la localizzazione nucleolare di pp65, la sintesi di rRNA, e la regolazione dell’ espressione genica di HCMV. Tra le funzioni nucleolari di possibile interesse per HCMV ed eventualmente legate anche alla sintesi di rRNA, l’attenzione si è concentrata sul ciclo cellulare, la cui regolazione avviene anche a livello nucleolare e la cui modulazione da parte di HCMV è nota in diversi modelli sperimentali. I dati ricavati dallo studio di questo importante aspetto supportano l’ipotesi di un ruolo potenzialmente rilevante di pp65, e della sua localizzazione nucleolare, nel controllo del ciclo cellulare da parte di HCMV (in grado di arrestare la proliferazione del modello cellulare utilizzato in fase G1-G1/S), e nel corretto avvio del programma litico virale. In particolare, i risultati ottenuti dimostrano che, sebbene l’ingresso del virus nella cellula ospite non sia influenzato dalla fase metabolica in cui questa si trova, la localizzazione dell’antigene virale pp65 a livello del nucleolo è significativamente maggiore in cellule in fase G1 e G1/S, rispetto a quelle che si trovano in S o in G2/M. In concomitanza, è stato osservato che solo cellule in fase G1 o G1/S sono in grado di sostenere una corretta ed efficiente realizzazione del ciclo litico di HCMV, che risulta, invece, fortemente penalizzato in S e in G2/M. Tali osservazioni avvalorano ulteriormente l’ipotesi di un possibile coinvolgimento di pp65 nei processi di regolazione e signaling correlati a funzioni nucleolari, come il controllo del ciclo cellulare. Al fine di individuare possibili partners molecolari con cui interagirebbe la proteina virale pp65 a livello del nucleolo, l’attenzione è stata rivolta allo studio di antigeni nucleolari di rilevanza nell’ambito del controllo del ciclo cellulare (oltre che della sintesi di rRNA), come nucleolina (C23), nucleofosmina, fibrillarina e UBF (“Upstream Binding Factor”). Esperimenti di microscopia confocale e di coimmunoprecipitazione reciproca, hanno indicato C23 quale uno dei possibili partners molecolari di pp65 a livello nucleolare. Questa ipotesi è stata ulteriormente supportata da esperimenti di silenziamento genico di C23. Sebbene si tratti di dati preliminari, tuttavia essi sembrano confermare un chiaro coinvolgimento di tale proteina nucleolare nell’interazione con la proteina pp65 di HCMV; infatti, in fibroblasti in cui era stato realizzato il silenziamento genico di C23, non si assisteva più alla localizzazione nucleolare di pp65. Inoltre, l’espressione delle proteine precocissime maggiori di HCMV era significativamente inibita, non solo come efficienza, ma anche relativamente alla loro dislocazione cellulare, con assenza di accumulo nucleare e presenza delle stesse a livello citoplasmatico.; SUMMARY The nucleolus is a nuclear domain involved in the biogenesis of ribosomes, as well as in many other important cellular regulatory activities, such as cell cycle control and mRNA transport and processing. Several literature data describe the involvement of the nucleolar compartment during the replication cycle of many viruses, including herpesviruses. In a previous study, we demonstrated the preferential targeting and accumulation of one of the major human cytomegalovirus (HCMV) tegument phosphoprotein (pp65) to the nucleolar compartment and, in particular, to the nucleolar matrix of lytically infected fibroblasts; such targeting was already evident at very early times after infection. The aim of the present study was to investigate the functional significance of HCMV pp65 targeting to the nucleolar compartment (particularly related to the HCMV gene expression over the course of the lytic program). First of all, we assessed the possible effects of rRNA synthesis inhibition on the development of HCMV lytic infection, by using either actinomycin D or cisplatin at low concentrations, that are known to selectively inhibit RNA polymerase I activity, and hence ribosome biogenesis, whilst leaving RNA polymerase II and III functions unaffected. Upon inhibition of rRNA synthesis by either agent, we observed a significant redistribution of nucleolar proteins within the nucleoplasm and a simultaneous depletion of viral pp65 from the nucleolus; this effect was highly evident in both unextracted cells and in nuclear matrices in situ. Of particular interest, even a brief suppression of rRNA synthesis resulted in a very strong inhibition of the progression of HCMV infection, as was concluded from the absence of accumulation of HCMV major immediate-early proteins within the nucleus of infected cells. These data suggest that a functional relationship might exist between rRNA synthesis, pp65 localization to the nucleolus and the normal development of HCMV lytic infection. Among nucleolar functions of potential interest for HCMV, and related to rRNA synthesis, we focused on cell cycle control, that occurs also in the nucleolus and which is modulated by HCMV. The original data arisen from the present study support the hypothesis of a potentially relevant role of pp65, and its nucleolar localization, in the control of the cell cycle by HCMV (that is known to induce a blockade of cell proliferation in G1–G1/S in many experimental models), and for the development of viral infection. Specifically, in this study we demonstrate that, although the incoming pp65 amount in the infected cells appears to be constant irrespective of the cell-cycle phases, its nucleolar accumulation is prominent in G1 and G1/S, but very poor in S or G2/M. This correlates with the observation that only cells in G1 and G1/S supported an efficient development of the HCMV lytic cycle, in contrast with S and G2/M phases, where infection was highly reduced. These data reinforce the hypothesis of HCMV pp65 involvement in regulatory/signaling pathways related to nucleolar functions, such as the cell-cycle control. In order to detect possible molecular partners of pp65 in the nucleolar compartment, we focused our attention on the relationship between this viral antigen and nucleolar proteins of interest in cell cycle and rRNA synthesis control, such as nucleolin (C23), nucleophosmin, fibrillarin and UBF (Upstream Binding factor). Confocal microscopy analysis and reciprocal co-immunoprecipitation point to C23 as a possible pp65 partner in the nucleolus. Accordingly, by preliminary experiments of C23 knockdown, pp65 was no longer found in the nucleolus of infected cells; moreover, in these experimental conditions we observed not only a significantly reduced expression of HCMV major immediate-early proteins, but also a lack of their nuclear accumulation and a poor presence in the cytoplasmic compartment. Thu, 17 Mar 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1591 2011-03-17T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1418 Title: Studi sull'immunizzazione nei confronti di aflatossine Authors: Giovati, Laura Abstract: Aflatossine (AF), metaboliti secondari tossici prodotti principalmente da ceppi dei funghi ubiquitari Aspergillus flavus e A. parasiticus, sono le più importanti micotossine di interesse medico (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2). In seguito all’ingestione di alimenti contaminati, AFB1 e AFB2, in particolare, sono in parte assorbite e trasportate al fegato dove vengono convertite nei rispettivi metaboliti idrossilati AFM1 ed AFM2. Attraverso il torrente circolatorio, AFM1 e AFM2 possono raggiungere altri organi e tessuti ed essere escrete attraverso la via biliare, urinaria o mammaria (processo di carry-over). AFB1, la forma prevalente tra le AF, e AFM1 sono state classificate dall’ International Agency for Research on Cancer (IARC) come cancerogeni di gruppo 1 e di gruppo 2B, rispettivamente, per l’uomo. Al fine di ridurre il rischio di esposizione per l’uomo e gli animali, i livelli massimi di AF tollerati in alimenti e mangimi sono stati variamente regolamentati in molti paesi. In questo studio, è stato verificato il potenziale vaccinale di AFB1-1(O-carbossimetil) ossima (AFB1-ox), chimicamente derivata da AFB1, coniugata ad emocianina (KLH), per la prevenzione del carry-over in vacche da latte intossicate con AFB1. Comparativamente a AFB1, AFB1-ox è stata dimostrata atossica e non mutagena in vitro nei confronti di cellule di epatocarcinoma umano e ceppi di Salmonella typhimurium, rispettivamente, e definita Anaflatossina B1 (AnAFB1). In seguito ad immunizzazione sistemica di vacche da latte con il coniugato AnAFB1-KLH, è stata rilevata l’induzione di anticorpi (IgG) sierici specifici per AFB1, presentanti reattività crociata decrescente con AFG1, AFB2 e AFG2, in grado di prevenire l’escrezione di AFM1 nel latte di vacche sottoposte a ripetuti cicli di ingestione di mangime contaminato da quantità note di AFB1. La vaccinazione di lattifere con AnAFB1-KLH potrebbe rappresentare la prova di concetto per la soluzione del problema aflatossicosi M1 da latte e prodotti derivati, quali formaggi e yogurt, nell’uomo.; Aflatoxins (AF), toxic secondary metabolites mainly produced by strains of Aspergillus flavus and A. parasiticus, represent the most important mycotoxins of medical interest (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2). Once ingested, AFB1 and AFB2, in particular, are partially adsorbed and transported to the liver where they are metabolized into the hydroxy derivates AFM1 and AFM2 which, through the bloodstream, may reach other tissues and organs and be excreted, via bile, urinary and mammary pathways (carry-over process). AFB1, the most prevalent and toxic among AF, and AFM1 have been included by the International Agency for Research on Cancer (IARC) in group 1 and 2B human carcinogens, respectively. To reduce human and animal exposure, AF maximum levels in foods and feeds have been variously regulated in many countries. In this study, the vaccinal potential of the AFB1 derivate AFB1-1(O-carboxymethyl) oxime (AFB1-ox) conjugated to keyhole limpet hemocyanin (KLH) for carry-over prevention in dairy cattles intoxycated with AFB1 is reported. In comparison with AFB1, AFB1-ox has proven to be nontoxic in vitro to human hepatocarcinomas cells and devoid of mutagenic activity in Salmonella typhimurium tester strains, being therefore defined as anaflatoxin B1 (AnAFB1). AnAFB1-KLH proved to be immunogenic in cows following systemic administration, inducing specific anti-AFB1 IgG serum antibodies decreasingly cross reacting with AFG1, AFB2 and AFG2. The elicited anti-AF Abs were able to overcome the excretion of AFM1 into the milk of cattles repeatedly fed with determined amounts of AFB1. Vaccination of dairy cattle with AnAFB1-KLH may represent the prove of concept for the solution of the public hazard constituted by milk and milk products, such as cheese an yoghurt, contaminated with AFM1. Sun, 28 Feb 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1418 2010-02-28T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1025 Title: Applicazione di metodologie molecolari nella diagnosi di malattia da infezione associata a Clostridium difficile Authors: Buttrini, Mirko Abstract: Clostridium difficile è un bacillo anaerobio, Gram-positivo, sporigeno, responsabile di una malattia diarroica e/o di coliti di varia gravità fino alla colite pseudomembranosa nonché uno dei maggiori responsabili di epidemie intraospedaliere. I principali fattori di virulenza di C. difficile sono rappresentati da due tossine principali: l’ enterotossina A (TcdA), la citotossina B (TcdB), codificate dai geni tcdA e tcdB localizzati nel Locus di patogenicità di C. difficile (PaLoc), e da una tossina addizionale, la tossina binaria (CDT), sintetizzata a partire da due diversi geni, cdtA e cdtB, localizzati esternamente al PaLoc. Alcuni ceppi di C. difficile producono tossine A e B varianti e presentano delezioni e/o mutazioni anche in altre regioni del PaLoc. Dal momento che queste mutazioni sono più frequenti in presenza dei geni codificanti per la tossina binaria, la presenza dei geni cdtA and cdtB è pertanto considerata un buon indicatore per la rivelazione di ceppi varianti di C. difficile. Ad oggi sono stati identificati 27 tipi di varianti, denominate da I a XXVII In questo studio sono stati analizzati 438 ceppi di C. difficile, isolati nel corso di setti anni (2000-2006) da 334 pazienti. Per caratterizzare la tossinogenicità dei ceppi, sono state applicate una duplex PCR per la ricerca dei geni tcdA e tcdB ed una PCR in grado di rilevare i geni cdtA e cdtB. Inoltre, è stata eseguita mediante PCR-ribotyping la tipizzazione dei ceppi isolati, allo scopo di tracciare un quadro epidemiologico sulla circolazione dei ribotipi di C. difficile nell’azienda ospedaliero-universitaria di Parma. Infine, è stato approfondito lo studio molecolare dei ceppi di C. difficile risultati varianti (cdtA/B+) con l’analisi del PaLoc mediante toxinotyping e successiva analisi del gene regolatore negativo tcdC, nonché con la verifica della loro sensibilità in vitro ad alcuni chemioantibiotici, fluorochinoloni in particolare come “marker” di patogenicità. Dei 438 ceppi complessivamente esaminati, 390 sono risultati tossinogenici e di questi 125 (32,1%) hanno presentato i geni codificanti per la tossina binaria, che caratterizza i ceppi varianti. Questi ultimi rappresentano il 44% dei ceppi tossinogenici isolati negli anni 2001-2003 e solo il 13% dei ceppi isolati negli anni 2004-2006, un dato che appare in controtendenza rispetto a quelli osservati in altri Paesi. Analizzando i 438 ceppi mediante PCR-ribotyping sono stati trovati 76 differenti ribotipi, arbitrariamente denominati. In particolare, nell’ambito dei 125 ceppi ctdA+ ctdB+ sono stati trovati 8 differenti ribotipi. Il ribotipo più diffuso tra i ceppi varianti è il ribotipo 1, che caratterizza il 94,4% di questi ceppi (118 su 125 totali); di questi ultimi 103 ceppi (82,4%) appartengono al sottotipo 1a risultato responsabile dell’epidemia, che ha coinvolto 15 pazienti ricoverati nei Reparti geriatrici (dic. 2002 - apr. 2003). I nostri ceppi ribotipo 1a sono stati riclassificati mediante pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e rinominati internazionalmente mediante PCR-ribotyping come NAP7/ribotipo 078. Quarantatrè dei 125 ceppi potenzialmente CDT+ sono stati selezionati, in base al ribotipo ed all’appartenenza allo stesso paziente, per le successive fasi di analisi del PaLoc e della sensibilità in vitro ai chemioantibiotici. Di questi l’ 86% ha mostrato di appartenere al tossinotipo V, che caratterizza anche la totalità dei ceppi ribotipo 1, mentre quattro sono stati tipizzati come tossinotipo XXIV ed hanno mostrato ribotipi differenti: 5 (2 ceppi), 11 e 16. Relativamente all’analisi mediante PCR-ribotyping dei 313 ceppi non varianti è stata rilevata la presenza di 4 ribotipi predominanti: il ribotipo 13 (45 ceppi, 14,4%), il ribotipo 17 (85 ceppi, 27,3%), il ribotipo 18 (32 ceppi, 10,3%) e il ribotipo 33 (28 ceppi, 9%). Tra questi, un ceppo appartenente al ribotipo 17 è risultato responsabile di una epidemia, che ha coinvolto 42 pazienti ricoverati nei Reparti pneumologici (apr.-sett. 2006). L’analisi del gene regolatore negativo tcdC ha messo in evidenza che i ceppi ribotipo 1 tossinotipo V posseggono un allele, già descritto in letteratura, denominato A1 che, oltre ad una delezione di 39 pb, presenta una mutazione non senso con la conseguente produzione di una proteina tronca non funzionale. Il quadro molecolare emerso suggerisce che questi ceppi sono da considerarsi iperproduttori delle tossine principali A e B. Questi ceppi ribotipo 1a tossinotipo V si sono dimostrati anche altamente resistenti ai fluorochinoloni, come riportato in letteratura. Una variabilità maggiore, al contrario, si è osservata con i ceppi che presentavano ribotipo diverso da 1. Sono state trovate, infatti, 5 nuove sequenze alleliche e tre proteiche non ancora descritte in letteratura. Inoltre, da segnalare è il ceppo ribotipo 2 tossinotipo XXIV, che ha presentato mutazioni insolite per questo tossinotipo, normalmente dotato di un PaLoc identico a quello del ceppo VPI 10463. Interessante è stato anche ritrovare in un ceppo ribotipo 2 un nuovo tossinotipo, non ancora descritto in letteratura. Il nostro studio sottolinea inequivocabilmente l’importanza dell’analisi molecolare, quando condotta per monitorare attentamente la circolazione dei ceppi di C. difficile in ambiente ospedaliero e particolarmente di quelli ipervirulenti, come dimostrano i ceppi Nap7/Ribotipo078 tossinotipo V, comparsi nel nostro ospedale nel 2002-2003, responsabili di una grave epidemia nosocomiale.; Clostridium difficile is a Gram-positive spore-forming anaerobic bacterium, often involved in severe C. difficile-associated disease (CDAD) and outbreaks in hospital settings. The main virulence factors of C. difficile are represented by two large toxins: toxin A (TcdA, enterotoxin), toxin B (TcdB, cytotoxin), encoded by tcdA and tcdB genes, located in the pathogenicity Locus of C. difficile (PaLoc), and an additional toxin, the binary toxin (CDT), codified by two different genes, cdtA and cdtB, located outside the PaLoc. Some strains produce variant toxin A and B and present deletions and/or mutations also in other regions of the PaLoc. Since these mutations are more frequent in presence of the genes encoding for the binary toxin, the presence of cdtA and cdtB genes is therefore considered a good marker to detect variant C. difficile strains. To date, 27 variant types have been identified, named from I to XXVII. In this study, 438 C. difficile strains have been investigated, isolated from 334 patients over a seven year period (2000-2006). A duplex PCR for the detection of tcdA and tcdB genes and a PCR to detect the cdtA and cdtB genes have been applied in the attempt to characterize their toxinogenicity. Furthermore, all the C. difficile isolates have been typed by PCR-ribotyping in order to draw an epidemiological feature of the different ribotypes circulating in the environment of the university hospital in Parma. In addition, a thorough molecular study of the C. difficile variant strains (cdtA/B+) has been done by toxinotyping and subsequent analysis of the negative regulator gene tcdC. Finally, the in vitro susceptibility to some antibiotics has been tested, in particular to fluoroquinolones as a marker of pathogenicity. Out of the 438 C. difficile isolates examined in total, 390 were toxigenic and, among them, 125 (32.1%) harboured the genes encoding for the binary toxin, which characterizes variant strains. These strains account for the 44% of the toxigenic strains isolated in the years 2001-2003 and only for the 13% of the strains isolated in the years 2004-2006, data which appear in contrast with those observed in other countries. Moreover, 76 different ribotypes, arbitrarily named, have been found among these 438 C. difficile strains by PCR-ribotyping. All the 125 variant strains ctdA+ ctdB+ belonged only to 8 different ribotypes and the ribotype 1 accounted for the 94.4% of the total strains. In particular, 103 strains (82.4%) have been classified to belong to the subtype 1a, which was responsible of a severe outbreak, involving 15 patients hospitalised in geriatric wards (Dec. 2002 - Apr. 2003). Of interest, the strains ribotype 1a have been reclassified by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and renamed internationally by PCR-ribotyping as NAP7/ribotype 078. Forty-three of the 125 potentially CDT+ strains have been selected, on the basis of the ribotype and their belonging to the same patient, for the subsequent phases of the PaLoc analysis and in vitro susceptibility to antibiotics. The 86% of these variant strains belonged to toxinotype V, which also included all the strains ribotype 1. Four of them were typed as toxinotype XXIV, but belonged to three different ribotypes: 5 (2 strains), 11 and 16. With regard to the 313 non variant strains analysed by PCR-ribotyping 4 different ribotypes have been predominantly detected: ribotype 13 (45 strains, 14.4%), ribotype 17 (85 strains, 27.3%), ribotype 18 (32 strains, 10.3%) and ribotype 33 (28 strains, 9%). Worthy of note, a C. difficile strain belonging to ribotype 17 has been proven to be responsible for an outbreak, which involved 42 patients hospitalised in pneumology wards (April-Sept. 2006). The analysis of the negative regulator gene tcdC has shown that the strains ribotype 1a toxinotype V had an allele, named A1, previously described in the literature. This allele, in addition to a 39-bp deletion, exhibited a non sence mutation with the consequent production of a truncated non-functional protein. This molecular framework suggests that these strains have to be considered hyper producers of the main toxins A and B. As expected, these ribotype 1a toxinotype V strains turned out in our hands to be highly resistant to fluoroquinolones. On the contrary, a greater variability was observed with the strains that showed ribotypes different from 1. In fact, 5 new allelic sequences and three proteins have been found, that had not described yet in the literature. Interestingly, the strain ribotype 16 toxinotype XXIV presented mutations that were unusual for this toxinotype, which normally has the same PaLoc of the reference strain VPI 10463. Moreover, worthy of note has been to find among the strains belonging to the ribotype 2 a new toxinotype, not yet described in the literature. Our study clearly highlights the importance of the molecular investigations in the attempt to monitor carefully the circulation of C. difficile strains in a hospital environment and particularly, of those hyper virulent strains, such as the Nap7/Ribotipo078 toxinotype V ones, which appeared in our hospital during the 2002-2003 period and were proven to be responsible for a severe nosocomial outbreak. Tue, 03 Mar 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1025 2009-03-03T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1022 Title: Diversità genetica e antigenica dei rotavirus umani : studio dei meccanismi evolutivi e implicazioni ai fini diagnostici e vaccinali Authors: Abelli, Laura Anna Abstract: I rotavirus sono la causa più importante di gastroenterite e di decessi ad essa correlati nei bambini al di sotto di 5 anni d’età, specialmente nei paesi in via di sviluppo. Nei paesi industrializzati, dove la mortalità è bassa e la morbilità è molto elevata, l’impatto dell’infezione da rotavirus sulla salute pubblica si ripercuote principalmente sui costi sanitari. Tra i numerosi aspetti che intervengono sulla diffusione e sui possibili veicoli di trasmissione dei rotavirus, uno di particolare rilevanza è la loro elevata variabilità genetica dovuta all’accumularsi di mutazioni puntiformi e alla natura segmentata del genoma che favorisce il riassortimento genico tra ceppi diversi in caso di co-infezione. Come conseguenza e anche sotto la pressione selettiva indotta dal vaccino, è possibile che varianti più resistenti riescano ad emergere e a diffondere rapidamente in una popolazione priva di anticorpi. E’ stato condotto uno studio molecolare dei rotavirus circolanti nell’area di Parma nella popolazione pediatrica ricoverata con gastroenterite in periodi temporalmente distanti (circa 20 anni) con lo scopo di elaborare un quadro epidemiologico molecolare utile ai fini diagnostici e vaccinali e di approfondire i meccanismi evolutivi e il potere patogeno di questo genere di virus. I risultati conseguiti hanno dimostrato che nell’area di Parma l’epidemiologia molecolare dei rotavirus di gruppo A è complessivamente sovrapponibile a quella osservata su scala globale negli ultimi decenni, con il genotipo G1P[8] prevalente e la specificità G9 emersa negli anni più recenti tra quelle maggiormente circolanti. Dai risultati ottenuti è stato anche evidenziato che l’elevata variabilità genetica di questi virus può rivelarsi attraverso l’emergenza di riassortanti intergenogruppo in grado di diffondere rapidamente nella popolazione e potenzialmente capaci di sfuggire alla protezione immunitaria indotta dal vaccino come pure attraverso la comparsa di mutazioni aminoacidiche in geni diversi, verosimilmente in grado di alterare la virulenza e il potere patogeno del virus. Inoltre, lo studio ha permesso di mettere in luce come la trasmissione zoonosica e il successivo riassortimento tra rotavirus umani e animali possano determinare l’introduzione di geni animali in ceppi umani attraverso un meccanismo di rilevante significato nell’evoluzione genetica di questi virus. Lo studio, infine, ha suggerito che l’epidemiologia molecolare dei rotavirus nell’uomo può risentire del recente aumento dei flussi migratori e del commercio internazionale, come farebbe supporre la dimostrazione della circolazione di ceppi di rotavirus di gruppo C nell’area di Parma, in cui, come nel resto d’Italia e in Europa, tali virus erano in precedenza assenti o perlomeno rari.; Rotaviruses are the leading cause of gastroenteritis and related deaths in children aged less than 5 years, mostly in developing countries. In industrialized countries mortality is low and morbidity is very high and the burden of rotavirus infection on public health is mostly on the sanitary costs. Among the various aspects that act on the spread and on the possible vehicle of transmission of rotaviruses, the high genetic variability is pivotal due to both point mutations and the segmented nature of the genome which favour the genetic reassortment between different strains during co-infections. As a consequence and under the selective immune pressure due to vaccines, it is likely that more resistant variants could emerge and spread in a non-immune population. A molecular study on rotaviruses circulating in the area of Parma in infants hospitalized with gastroenteritis in time-distant periods (20 years) was performed with the aim to gain a picture of the rotavirus molecular epidemiology, useful for rotavirus diagnosis and vaccination, and to further understand the rotavirus genetic evolutive mechanisms and pathogenicity. The results demonstrated that the group A rotavirus molecular epidemiology in the area of Parma is characterized by the prevalence of G1P[8] strains and the emergence of G9 strains, as observed worldwide in the last decades. The results also pointed out that the rotavirus high genetic variability can lead to the appearence of intergenogroup reassortants, able to quickly spread in the population and potentially to escape from the vaccine immune protection, as well as to the emergence of amino acid mutations in some genes that could modify the strain virulence and pathogenicity. Moreover, the study highlighted that the rotavirus zoonotic transmission and the subsequent reassortment between human and animal strains can introduce animal genes in the genome of human rotaviruses through a significant mechanism in the rotavirus genetic evolution. Finally, the study suggested that the rotavirus molecular epidemiology in humans is likely under the influence of the changing demographic dynamics (fluxes of migrations) and increased trades, since group C rotaviruses appeared in the area of Parma where they were previously absent or rare as in the rest of Italy and Europe. Tue, 03 Mar 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1022 2009-03-03T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/784 Title: Attività biologica differenziale di CDR di anticorpi Authors: Maffei, Domenico Leonardo Abstract: Peptidi sintetici corrispondenti ai CDR (regioni determinanti complementarietà) di differenti anticorpi hanno mostrato di esplicare attività biologica differenziale indipendentemente dalla specificità degli anticorpi nativi. I CDR di anticorpi monoclonali diretti contro: 1) un antigene di C. albicans (mAb C7); 2) un peptide sintetico costituito da epitopi B e T (mAb pc42, che condivide due CDR con mAb C7); 3) il più frequente antigene di gruppo sanguigno A (mAb HuA, non presentante CDR condivisi con mAb C7 e pc42), hanno mostrato di possedere, in vitro, ex-vivo e/o in vivo, attività differenziale nei confronti di agenti patogeni microbici e virali di rilevanza clinica e cellule di melanoma. Lo studio dei peptidi ottenuti mediante alanine scanning dai CDR ha permesso di verificare per alcuni di essi una significativa variazione dell’attività biologica rispetto a quella del CDR originale. L’elevata frequenza di peptidi biologicamente attivi derivati dai CDR fa ipotizzare che le immunoglobuline costituiscano una fonte di sequenze aminoacidiche potenzialmente attive nei confronti di agenti eziologici di malattie da infezione e cellule tumorali. L’ingegnerizzazione peptidica e l’ottimizzazione chimica associate alla scoperta di nuovi meccanismi d’azione potrebbero risultare determinanti per la razionale identificazione di una nuova generazione di potenziali agenti terapeutici antimicrobici, antivirali ed antitumorali.; Synthetic peptides representing the complementarity-determining regions (CDRs) of different antibodies have shown to display differential biological activities independent of the specificity of the native Ab. CDR-based synthetic peptides of monoclonal Abs directed to: a) a protein epitope of Candida albicans cell wall stress mannoprotein (mAb C7); b) a synthetic peptide containing well-characterized B-cell and T-cell epitopes (mAb pc42, sharing two CDRs with mAb C7); c) a carbohydrate blood group A substance (mAb HuA, sharing no CDR homology with either mAbs C7 or pc42) showed differential inhibitory activities in vitro, ex vivo and/or in vivo against prokaryotic and eukaryotic microorganisms, HIV-1 and B16F10-Nex2 melanoma cells, conceivably involving different mechanisms of action. Engineered peptides, obtained by alanine substitution of CDR sequences, showed further differential increased/unaltered/decreased antimicrobial, antiviral and/or antitumor activities. The high frequency of bioactive peptides based on CDRs suggests that Ig molecules are sources of an unlimited number of sequences potentially active against infectious agents and tumor cells. The easy production and low cost of small sized synthetic peptides representing CDRs and the possibility of peptide engineering and chemical optimization associated to new delivery mechanisms are expected to give rise to a new generation of therapeutic agents. Description: Il testo della tesi sarà accessibile dal 1 giugno 2010 Mon, 31 Dec 2007 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/784 2007-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/783 Title: Metodi molecolari per la diagnosi di laboratorio e lo studio epidemiologico delle infezioni da Entamoeba histolytica e da Entamoeba dispar Authors: Gorrini, Chiara Abstract: Il riconoscimento su basi genetiche, immunologiche e biochimiche dell’esistenza delle due specie Entamoeba histolytica ed Entamoeba dispar, identiche dal punto di vista morfologico ma con un alto grado di divergenza dal punto di vista biologico (la prima patogena e agente eziologico di amebiasi intestinale ed extraintestinale, importante problema di salute pubblica in termini di morbidità e mortalità a livello mondiale, la seconda in grado di colonizzare l’intestino umano ma non patogena) ha avuto importanti implicazioni sulla diagnosi di laboratorio di amebiasi e sull’epidemiologia di tale malattia. In questa tesi, secondo le raccomandazioni dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, sono stati valutati due saggi molecolari per la differenziazione di E. histolytica ed E. dispar al fine di ottenere una pronta ed accurata diagnosi di laboratorio di amebiasi e sono stati condotti uno studio di prevalenza delle infezioni da E. histolytica e da E. dispar nell’area di Parma in un periodo quinquennale e uno studio collaborativo di genotipizzazione comparativa di coppie di ceppi di E. histolytica identificati rispettivamente nelle feci e nel liquido aspirato da ascesso epatico di pazienti con amebiasi intestinale-extraintestinale, al fine di contribuire a chiarire la possibilità che il genotipo del ceppo infettante intervenga nel determinismo della manifestazione clinica dell’infezione.; The classification of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar as separate but not microscopically distinguishable species (the former pathogenic and aetiological agent of intestinal and extraintestinal amoebiasis, problem of great impact on public health in terms of morbidity and mortality, the latter able to colonize human intestine but not pathogenic) has affected both the laboratory diagnosis of amoebiasis and its epidemiology. In this thesis, in light of the recommendations of the World Health Organization, the utility of conventional PCR and real-time FRET PCR as methods for the detection and identification of E. histolytica and E. dispar in clinical samples to routinely diagnose amoebiasis was evaluated. Moreover, the respective proportions of E. histolytica and E. dispar in a non-endemic area (Parma, Italy) in a 5 years-period were estimated. Finally, a collaborative comparative study of genotyping of couples of intestinal and extraintestinal E. histolytica strains belonging to patients with amoebic liver abscess was performed, in order to give a contribution to the comprehension of the possibility that the parasite genotype plays a role in determining the clinical manifestation of the infection. Mon, 31 Dec 2007 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/783 2007-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/765 Title: Alcuni possibili meccanismi di regolazione dell'espressione genica di citomegalovirus umano in un modello di infezione latente in vitro Authors: Motta, Federica Abstract: I monociti THP-1 possono essere infettati latentemente con lo stipite Towne di citomegalovirus umano (HCMV); tali cellule diventano permissive all’infezione litica da HCMV dopo induzione del differenziamento cellulare. Questo duplice modello di infezione è stato impiegato per studiare il possibile ruolo di meccanismi di regolazione epigenetica, quali modificazioni istoniche e metilazione del DNA, nella modulazione dell’espressione genica di HCMV. Lo studio della metilazione della regione “enhancer” dei geni virali IE non ha dato risultati conclusivi; d’altra parte, mediante un protocollo di immunoprecipitazione della cromatina è stata dimostrata un’associazione prevalente dei geni virali alle forme acetilata o dimetilata in lisina (K) 9 dell’istone H3 nei modelli di infezione litica e latente, rispettivamente. Per quanto attiene all’“enhancer” virale, esso è predominantemente associato ad H3 acetilato in K9 nel modello litico, mentre in corso di infezione latente è stata osservata una condizione intermedia, ossia assenza di significativa associazione ad H3 acetilato o dimetilato. È plausibile supporre che gli stessi tipi di modificazioni istoniche siano utilizzati per marcare i geni attivi o repressi nell’ambito sia della cromatina cellulare, sia del genoma virale. L’analisi della compartimentalizzazione dei trascritti di latenza ha permesso di evidenziare una prevalenza di RNA antisenso nei nuclei di THP-1 infettate latentemente.; THP-1 monocytes can be latently infected by human cytomegalovirus (HCMV) Towne strain and switched to a lytic cycle upon differentiation. We used this dual cellular model to gain insights into the role of epigenetic mechanisms, like histone modifications and DNA methylation in the control of HCMV gene expression. While no final results were obtained in the study of viral IE genes enhancer methylation, by using a chromatin immunoprecipitation protocol we were able to demonstrate that HCMV genes were associated preferentially with acetylated histone H3 (K9 position) in lytically infected cells and with dimethylated K9-H3 during latency. As to HCMV enhancer, the association with acetylated K9-H3 largely prevailed in lytically infected THP-1 cells; conversely, a quite intermediate situation was observed during latent infection, in that the above region was associated with neither acetylated, nor dimethylated H3. Taken together, these data suggest that, similarly to cellular chromatin, K9 methylation of H3 is involved in HCMV gene repression, while association with acetylated histones is likely to be necessary for active transcription. The presence and sub-cellular compartmentalization of latency transcripts was also tested in this experimental model, and the presence of an anti-sense RNA was predominantly observed in nuclei of latently infected THP-1 cells. Mon, 31 Dec 2007 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/765 2007-12-31T23:00:00Z