http://hdl.handle.net/1889/659 Wed, 22 May 2013 06:51:58 GMT 2013-05-22T06:51:58Z http://hdl.handle.net/1889/1943 Title: Scoperta e caratterizzazione di un nuovo gene oncosoppressore: MITOSTATIN Authors: Baffa, Raffaele Abstract: La delezione allelica della regione telomerica del cromosoma 12 (in particolare la regione 12q24) è un’alterazione genetica frequentemente descritta in letteratura in neoplasie maligne solide dell’uomo. Tuttavia, non è stato finora identificato in tale regione cromosomica un possibile gene oncosopressore. Nel corso dei precedenti anni accademici abbiamo prima identificato un nuovo gene, denominato MITOSTATIN, localizzato su 12q24.1, che risultava over-espresso in tre differenti linee cellulari over-esprimenti il proteoglicano decorina. Abbiamo poi evidenziato come MITOSTATIN sia espressa, anche se a livelli diversi, in tutti i tessuti umani da noi testati e caratterizzato la funzione di questa nuova possibile oncoproteina a sede mitocondriale come un possibile regolatore sia della morfologia mitocondriale che della organizzazione ultra-strutturale dei mitocondri (da cui il nome). Abbiamo infine dimostrato che MITOSTATIN: 1. induce una drammatica riduzione nella sintesi del DNA; 2. inibisce la formazione di colonie cellulari; 3. interferisce con i processi di migrazione e di invasione cellulare; 4. è mutato in linee cellulari tumorali; e 5. la sua espressione è persa in tumori primitivi della vescica, della mammella e della prostata. In conclusione, i nostri risultati indicano che MITOSTATIN si comporta come un tipico gene oncosoppressore nei tumori solidi e presenta un nuovo meccanismo d'azione cellulare e molecolare che deve essere ulteriormente caratterizzato. Wed, 29 Feb 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1943 2012-02-29T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1942 Title: Phase II study of Letrozole, metronomic Cyclophosphamide and Sorafenib as neoadjuvant therapy in patients with operable breast cancer: pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis. Authors: Bazzola, Letizia Abstract: La tesi ha preso in considerazione gli aspetti farmacocinetici e farmacodinamici dello studio clinico "trattamento neoadiuvante con Letrozole, Ciclofosfamide e Sorafenib in donne in menopausa con tumore della mammella operabile". Nello studio sono state arruolate 13 pazienti in menopausa con carcinoma mammario T2-4, N0-1 con recettori ormonali positivi. Le donne sono state trattate con letrozolo 2,5 mg/die, ciclofosfamide 50 mg/die e sorafenib 400 mg/bid. Al basale, ad ogni mese e alla fine del trattamento sono state effettuate le visite con valutazioni radiologiche (PET e MRI) e chirurgiche per le analisi farmacodinamiche. Per le analisi farmacocinetiche sono stati effettuati prelievi di sangue seriali. Analisi di target gene sono state effettuate sui campioni di tessuto prelevati. Dall’analisi dei risultati farmacodinamici si nota che la combinazione di ciclofosfamide metronomica, letrozolo e sorafenib è un trattamento ben tollerato. Inoltre i dati di proliferazione e risposta tumorale (clinica) e metabolica (PET) dimostrano che l’associazione dei tre farmaci è promettente nel tumore della mammella. Dai dati di farmacocinetica si dimostra che non vi è interazione significativa tra ciclofosfamide e sorafenib. In conclusione il trattamento è ben tollerato. Per meglio individuare il ruolo biologico di sorafenib sono in atto ulteriori studi di gene expression profile. Wed, 29 Feb 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1942 2012-02-29T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1909 Title: Studio dei meccanismi di morte dopo somministrazione di catechine estratte dal tè verde in cellule epiteliali prostatiche immortalizzate e tumorigeniche. Authors: Silva, Alessandro Abstract: L’infuso di foglie di tè verde (C. sinensis) è una bevanda estremamente popolare in tutto il mondo il cui consumo abituale, secondo solo a quello dell’acqua, è da tempo stato associato a benefici per la salute. Tra questi, oltre ad esiti positivi sul diabete, obesità e malattia neurologiche, quello più rilevante è l’effetto chemiopreventivo in un ampio ambito di patologie tumorali. A tal proposito è da tempo stabilito come, gran parte degli effetti benefici generali e di possibile chemioprevenzione del cancro da parte del tè verde, siano mediate da alcuni dei suoi componenti, i polifenoli e, soprattutto la -(-)epigallocatechin-3-gallato (EGCG), la catechina più abbondante in assoluto (50-80% del peso secco di una foglia; 200-300 mg in una tazza di tè verde). L’attività chemiopreventiva dell’EGCG è supportata da osservazioni epidemiologiche, studi su colture cellulari, su modelli animali e sull’uomo. Recenti studi clinici di fase I e II sono stati condotti per esplorare gli effetti chemiopreventivi dell’EGCG negli esseri umani rivelando come il trattamento con EGCG inibisce, con varie modalità ed in organi diversi (quali fegato, pomone, stomaco, seno, prostata e colon), la proliferazione e la trasformazione di cellule pre-neoplastiche e neoplastiche come pure la neoangiogenesi, l’invasione del tumore e la formazione di metastasi in organi diversi come fegato, stomaco, polmone, seno, prostata e colon. Numerodi studi in vitro hanno evidenziato come l’EGCG induca l’arresto della crescita, alterando l’espressione di proteine che regolano il ciclo cellulare e sopprimendo l’espressione di alcuni oncogeni. Provoca inoltre morte cellulare modificando il rapporto delle proteine Bcl2/Bax in maniera da favorire l’apoptosi. Il blocco della proliferazione e l’induzione di morte cellulare sono indipendenti dallo stato della proteina p53 ma, in generale, è possibile affermare che, cellule aventi una p53 funzionante rispondono a dosi inferiori di EGCG. È stato suggerito che i polifenoli estratti dal tè verde siano in grado di inibire il processo di carcinogenesi, modulando una vasta gamma di vie di trasduzione del segnale coinvolte nello sviluppo del cancro, quali Jak/STAT, MAPK, PI(3)K/Akt, Wnt, Notch. È stato anche proposto che, almeno in vitro, le catechine estratte dal tè verde siano inibitori dell’attività del proteasoma e che, quindi, interferiscano con le vie di degradazione delle proteine ubiquitina-dipendenti. É interessante notare come gli effetti antiproliferativi e pro-apoptotici delle catechine del tè verde siano specifici per le cellule trasformate, mentre non si riscontrino effetti tossici su colture primarie di cellule normali. Risultati ottenuti in studi precedentemente pubblicati dal nostro gruppo di ricerca e da altri autori, hanno confermato che l’EGCG risulta efficace nell’inibire la proliferazione sia di cellule epiteliali prostatiche immortalizzate non tumorigeniche (PNT1a), sia di cellule pienamente trasformate, metastatiche, androgeno indipendenti e tumorigeniche, quali le PC-3, risultando invece inefficace in cellule epiteliali prostatiche normali in coltura primaria. Questo risultato è particolarmente importante, in quanto evidenzia che l’effetto citotossico e citostatico delle catechine del tè verde è specifico per le cellule trasformate. I dati raccolti hanno confermato come la somministrazione di Polyphenon E® (Poly-E) risulti citotossica per entrambe le linee cellulari, PNT1a e PC-3, sebbene le concentrazioni di inibizione della proliferazione (IC50), siano diverse nelle due linee (rispettivamente 35 µg/mL e 145 µg/mL). Inoltre, abbiamo verificato che le due linee cellulari rispondono al trattamento con Poly-E attivando percorsi molecolari diversificati, nei modi e nei tempi di attuazione, che portano in ogni caso all’inesco di un meccanismo di morte programmata. Le PNT1a reagiscono al trattamento con Poly-E attraverso meccanismi inzialmente citoprotettivi. L’innesco del processo autofagico, che abbiamo verificato fra le 6 e le 12 ore di trattamento, è da considerarsi un evento marginale e transitorio, con funzioni pro-sopravvivenza. Esso risulta anche causa di una concomitante e transitoria attivazione di meccanismi associati a stress del reticolo endoplasmatico (ERS), che tendono ad autolimitarsi dopo le 12 ore. Dalle 24 ore in avanti, gli inziali percorsi di sopravvivenza messi in atto da queste cellule lasciano il posto all’attivazione di un programma di apoptosi intrinseca che coinvolge sia le propteine BH3-only (membri pro-apoptotici della famigglia Bcl-2) che il clivaggio delel caspasi -9, -7 e -3. Il tutto si conclude con l’attivazione della PARP e la frammentazione del DNA, mentre, in concomitanza, le cellule perdono il contatto con la superficie di crescita e se ne distaccano (morte per anoikis). Le cellule PC-3 sono più resistenti delle PNT1a al trattamento con le catechine, e richiedono concentrazioni più elevate di Poly-E (145 µg/mL) per andare incontro prima al blocco della proliferazione e poi a morte. Il processo morfologico più evidente nelle cellule PC-3 dopo la somministrazione di Poly-E è una massiccia vacuolizzazione citoplasmatica che porta a stravolgere l’aspetto della cellula la quale rimane comunque aderente al substrato di crescita fino alla morte. Le indagini da noi svolte hanno permesso di appurare come, in queste cellule, il Poly-E induca un marcato e persistente ERS, che si concretizza nell’induzione del fattore di trascrizione ATF4 e, di conseguenza, nell’aumento della trascrizione di eIF2α (poi fosforilata), GADD34 e CHOP, noti marcatori di stress del reticolo. L’aumento dell’espressione di questi geni è stato anche verificato a livello di proteina. p38 MAPK è un membro della famiglia di MAP chinasi attivato tramite fosforilazione in risposta a varie tipologie di stress. Mentre il percorso di ERK (MAPK attivate da segnali extracellulari) regola principalmente un programma di proliferazione e sopravvivenza, la via di segnalazione che coinvolge JNK è in grado di promuovere sia la proliferazione che l’apoptosi. È già noto in letteratura come la via di p38 MAPK, può essere implicata nella soppressione della tumorigenesi, poichè inibisce la proliferazione cellulare attraverso una riduzione dell’espressione della ciclina D1 e il coinvolgimento di geni oncosoppressori quali p16/Rb e p19ARF/p53. Mentre in cellule PNT1a il ruolo di p38 MAPK, sulla base delle indagini dai condotte, non appare definibile con chiarezza, nelle cellule PC-3 abbiamo verificato una marcata attivazione di p38α dopo 24 ore di trattamento con Poly-E, che si mantiene fino a 48 ore. L’aumento della fosforilazione di p38α, nelle cellule PC-3, correla con l’aumento dell’espressione di proteine pro-apoptotiche della famiglia Bcl-2, come PUMA e Bax, coinvolte nell’attivazione della via di morte che culmina con l’aumento della permeabilizzazione della membrana mitocondriale ed il rilascio di AIF. Non possiamo inoltre escludere che, sempre p38α, sia coinvolto nell’attivazione di CHOP di concerto con ATF4, e contribuisca a mantenere elevati i valori di questo marcatore di ERS. In conclusione, i nostri dati evidenziamo come il reticolo endoplasmatico rappresenti un bersaglio cellulare particolarmente importante nel meccanismo di azione antiproliferativo e pro-apoptotico delle catechine del tè verde. Ulteriori approfondimenti saranno necessari per delucidare, in termini meccanicistici, quali molecole intervengano fra l’induzione dell’ERS, l’UPR e l’attivazione di meccanismi effettori di morte cellulare. Gli estratti standardizzati di catechine del tè verde si propongono come agenti naturali nella prevenzione del cancro per la loro assenza di tossicità sicurezza, i bassi costi e la biodisponibilità. Pertanto potrebbero risultare utili ulteriori approfondimenti sulla valutazione dell’utilizzo delle catechine da sole o in combinazione con terapie convenzionali per la prevenzione della progressione progressione tumorale e/o il trattamento delle neoplasie umane. Thu, 22 Mar 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1909 2012-03-22T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1908 Title: Aortic and mitral valve disease: surgical implications of oxidative stress Authors: Kassem, Samer Abstract: Aortic and mitral valve diseases are progressively increasing in the Western world, affecting an increasing number of patients. Data from the STS database, the voluntary database that collect data from the vast majority of the USA cardiac surgical centers have shown a steed increase in the surgical procedures done for these two pathologies.From 2001 and 2010, there has been a significant increase for isolated aortic valve replacement (AVR) (from 9656 to 25219 cases) for mitral valve repair (MVRep) (from 2.755 to 7.207 cases), and this is also true for mitral valve replacement (MVR), AVR + CABG, and MVRep + CABG. This epidemic of valve disease is due in part to ageing population of Western countries but also to some unknown factors. In this thesis we will analyze the molecular mechanisms of aortic valve stenosis and mitral valve prolapsed, the possible surgical implications and linking and the role of oxidative stress as a potential main factor in the occurrence and progression of these diseases. Sun, 25 Mar 2012 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1908 2012-03-25T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1907 Title: Looking for the holy well of tissue regeneration: isolation, characterization and differentiation into hard tissues of multipotent cells from human placenta Authors: Bianchera, Annalisa Abstract: The improvement of life quality and lifespan lengthening in Western countries leads as a consequence a more and more urgent need for organs and tissues replacement. As organs and tissues derived from heterologous donors are not easily available and, moreover, oblige to a life-spanning use of immunosuppressive drugs, effective alternatives are needed. The aim of this work was the investigation of the regenerative potential nested in placenta, as an ethically acceptable and promising source of multipotent cells for tissue repair. A protocol is reported that allows the isolation from placenta of a homogeneous population of human chorionic multipotent stromal cells (hCMSCs) by the combination of plastic adherence and subsequent cell sorting of CD34neg cells. This population displays the typical characteristics of mesenchymal stem cells and exhibits clonal properties, as testified by the analysis of surface markers and doubling time. As for the differentiation potential, evidence was provided on the ability of hCMSCs to differentiate into osteoblastic cells as well as into adipoblasts and chondroblasts. In particular, concerning chondrogenic differentiation, culture protocols were useful to get the induction of the expression in hCMSCs of typical chondrogenic genes, but some work still has to be done in order to obtain a clear hyaline cartilage to satisfy the target of articular cartilage regeneration. Moreover hCMSCs possess an osteogenic potential if cultivated in appropriate conditions. When a canonical osteoinductive medium was used, differentiation towards the osteogenic lineage was scanty and only small calcified nodules were visualized. In order to improve these results, cells were grown in the presence of collagen or Bio-oss® as substrates. Collagen didn’t influence gene expression of hCSMCs, while the presence of Bio-oss®, especially if combined with an osteogenic medium, allowed better differentiation and maturation of cells into osteoblasts or osteocytes. In experiments performed on a rat model of critical size defect, hCMSCs confirmed their ability to settle and proliferate on Bio-oss® scaffolds. Moreover those cells were able to fill the created defect by forming a soft compact tissue. On the whole, data collected in this PhD thesis suggest that placenta could be an effective and abundant source of cells for tissue regeneration.; Il miglioramento della qualità e l’allungamento dell’aspettativa di vita nei Paesi occidentali comportano una sempre più urgente necessità di sostituire organi e tessuti. Dato che le donazioni di organi sono assolutamente insufficienti e che, inoltre, il trapianto eterologo obbliga all’assunzione per tutta la vita di farmaci immunosoppressori, appare evidente la necessità di fonti alternative di tessuti. Lo scopo dello studio era l’analisi del potenziale rigenerativo insito nella placenta umana, considerata una fonte eticamente accettabile ed estremamente promettente di cellule multipotenti per la rigenerazione tissutale. La tesi riporta un protocollo che consente l’isolamento dalla placenta di una popolazione omogenea di cellule multipotenti stromali (hCMSCs) grazie alla combinazione di adesione su plastica e successiva selezione immunomagnetica delle cellule CD34-. Questa popolazione mostra le caratteristiche tipiche delle cellule mesenchimali e possiede proprietà clonali, come testimoniato dall’analisi dei markers superficiali e dai tempi di duplicazione. Per quanto riguarda il potenziale differenziativo, si dimostra che le hCMSCs sono in grado di differenziare in adipoblasti, condroblasti e osteoblasti. In particolare, a proposito del differenziamento cartilagineo, sono stati adottati protocolli di coltura utili all’ottenimento dell’induzione dell’espressione da parte delle hCMSCs di geni tipici del tessuto cartilagineo. Tuttavia, il tessuto ottenuto mostra caratteristiche fibrocartilaginee, che suggeriscono la necessità di migliorare ulteriormente le condizioni di differenziamento al fine di ottenere un sostituto funzionale per la cartilagine ialina articolare. Inoltre le hCMSCs sono in grado di differenziare in tessuto osseo, se opportunamente trattate. L’utilizzo di un medium osteoinduttivo classico produce solo un modesto differenziamento e una scarsa deposizione di noduli calcificati. Per migliorare tali risultati le cellule sono state coltivate in presenza di collagene o Bio-oss® come substrati. Il collagene non influisce sull’espressione genica delle hCMSCs, mentre la presenza Bio-oss®, specialmente se associata ad un medium osteogenico adeguato, consente un differenzamento più completo ed una migliore maturazione delle cellule in osteoblasti e osteociti. Negli esperimenti condotti in vivo su un modello murino di difetto critico le hCMSCs hanno confermato la capacità di colonizzare gli scaffold di Bio-oss® e di proliferare su di essi. Inoltre tali cellule sono state in grado di colmare il difetto creato originando un tessuto molle compatto. Nel complesso i dati raccolti in questo lavoro di tesi suggeriscono che la placenta può costituire effettivamente una fonte utile ed abbondante di cellule per la rigenerazione tissutale. Sat, 31 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1907 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1624 Title: Genotipizzazione di marcatori di suscettibilità mediante studio caso-controllo nelle vasculiti anca-associate e nella fibrosi retroperitoneale idiopatica Authors: Martorana, Davide Abstract: Le vasculiti sono un gruppo eterogeneo di malattie autoimmuni che hanno in comune fenomeni flogistici e necrotici a carico delle pareti dei vasi, con conseguente ischemia e necrosi dei tessuti a valle. Possono essere primarie o secondarie e sistemiche o limitate ad un organo. Nel presente studio sono state considerate 3 vasculiti dei piccoli vasi, definite ANCA-associate (Antineutrophil Cytoplasmic Antibody), in quanto presentano anticorpi anticitoplasma del nucleo dei neutrofili : Granulomatosi di Wegener (WG), Sindrome di Churg-Strauss (CSS) e Poliangite microscopica (MPA). Oltre a queste tre è stata considerata anche la Fibrosi Retroperitoneale Idiopatica (IRF), patologia che per alcune caratteristiche è assimilabile alle vasculiti dei grandi vasi. I pazienti (tutti di origine Italiana) sono stati reclutati in gran parte dalla U.O. Nefrologia dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma, e i restanti da altre Aziende Ospedaliere e strutture Universitarie che hanno collaborato nello studio. I progetti sono stati approvati dal Comitato Etico Unico per la provincia di Parma. La valutazione è stata basata sulle metodiche di discriminazione allelica mediante varie tecniche, fra le quali PCR Real-Time e sequenziamento del DNA. Le frequenze alleliche dei pazienti e dei controlli sono risultate essere tutte in equilibrio di Hardy-Weinberg. Gli studi caso-controllo sono stati analizzati mediante analisi statistica. Gli studi sono iniziati nel 2005 ed hanno portato all’identificazione di diversi marcatori genetici associati alle patologie indagate, pubblicati su riviste internazionali peer-review. Oltre a progetti nazionali, sono stati effettuati (e sono in corso tuttora) studi multicentrici europei volti ad indagare varianti di suscettibilità in tutto il genoma. Fri, 31 Dec 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1624 2010-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1586 Title: Studio sulla funzione di clusterina nel linfoma di Hodgkin Authors: Frazzi, Raffaele Abstract: Clusterina è una proteina da stress ampiamente espressa nei tessuti e nei fluidi umani. Tuttavia vi sono poche informazioni riguardo alla sua funzione nei linfomi. In questo lavoro dimostriamo che la sua espressione in linee cellulari di linfoma di Hodgkin aumenta in risposta a diversi stimoli tra cui doxorubicina, interferon-gamma ed alte dosi di raggi X. La sua forma circolante è dosabile nel siero di pazienti affetti da linfoma di Hodgkin e sembra essere correlata con la persistenza del tessuto neoplastico ipercaptante dopo due cicli di chemioterapia.; Clusterin is a molecular chaperon widely studied in cancers of epithelial origin. On the contrary, the information available on its functions in lymphomas are still quite poor. Here we demonstrate clusterin up-regulation in Hodgkin lymphoma derived cell lines as caused by doxorubicin, interferon-gamma and high doses of X-rays. We also present preliminary data on the quantitation of secretory clusterin in sera from Hodgkin lymphoma patients. The preliminary data show a correlation between the persistence of hypercaptating neoplastic mass and the increase in circulating clusterin. Fri, 31 Dec 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1586 2010-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1488 Title: Studio cito-istologico di superfici biomimetiche ad elevata funzione osteogenica Authors: Ravanetti, Francesca Abstract: La ricerca implantologica attuale in materia di impianti osteointegrati è volta al disegno di materiali, definiti bioattivi, che permettano il controllo, guidino e rendano possibile una più rapida guarigione. In questo ambito il materiale di elezione è rappresentato dal titanio e dalle sue leghe. Materiale bioinerete con proprietà intermedie, il titanio, rappresenta un giusto compromesso tra necessità meccaniche e biologiche, grazie alle sue proprietà specifiche di ottima biocompatibilità, elevata resistenza meccanica ed elevata resistenza alla corrosione. È possibile affermare che con gli attuali sviluppi gli impianti in titanio hanno raggiunto una buona osteointegrazione sia in termini qualitativi sia quantitativi; quindi lo scopo principale delle attuali ricerche non è il miglioramento dell’osteointegrazione, ma l’accelerazione nei processi che vi concorrono. Questo consentirebbe non solo un più rapido recupero da parte del paziente ma anche una stabile fissazione tra osso e impianto, che permetterebbe un carico più precoce. La ricerca di metodiche volte a migliorare l’interfaccia osso-impianto che permettano di considerare il titanio non più come materiale bioinerte, ma bioattivo si è orientata secondo tre approcci diversi: metodi fisici, metodi chimici-elettrochimici e biochimici. Con il presente studio si intende indagare, mediante ricerche in vitro ed in vivo, il comportamento delle cellule e l’osteointegrazione primaria del tessuto osseo in risposta a impianti in titanio con superfici ad elevata funzione osteogenica. Nello specifico saranno descritti due differenti studi: il primo volto a valutare due superfici ottenute mediante trattamenti elettrochimici di deposizione anodica, il secondo volto a valutare un trattamento biochimico di funzionalizzazione peptidica con il nonapeptide HVP (351-359) mappato dalla vitronectina umana mediante approccio di mimica peptidica ed immobilizzato covalentemente. Studi effettuati in diversi modelli animali sono concordi nell’affermare che, per quanto concerne la risposta ad impianti endossei, le prime fasi del processo di osteointegrazione con relativa neoformazione ossea all’interfaccia sono già osservabili entro le due settimane dall’impianto. In relazione alle finalità dei trattamenti di superficie del titanio, nei presenti studi abbiamo voluto analizzare la risposta ossea primaria all’impianto considerando brevi tempi sperimentali; a questo scopo abbiamo utilizzato un modello animale a rapido accrescimento e turn over osseo come il coniglio ed effettuato l’analisi istologica e l’analisi istomorfometrica di parametri sia statici sia dinamici. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1488 2009-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1487 Title: Leucemia acuta mieloide con traslocazione t(9;11)(p22;q23) Authors: Martino, Vincenzo Pio Abstract: La traslocazione t(9;11)(p22;q23) genera l’oncogene MLL-AF9 ed è comunemente associata con la leucemia acuta mieloide monocitica (LAM-M5; classificazione FAB). Per l’oncogenicità di MLL-AF9, è richiesta l’(over)espressione di diversi altri geni, tra cui HOXA4, 5, 6, 7, 9, 10 e 11 (definiti come “HOXA-code” genes), MEIS1 (un cofattore delle proteine “HOXA-code”) e MYB. Precedentemente, abbiamo riportato che la down-regolazione dell’espressione di MLL-AF9 non era obbligatoria per la maturazione monocito-macrofagica in cellule di LAM-M5 con traslocazione t(9;11)(p22;q23). In questo studio abbiamo analizzato l’espressione dei geni “HOXA-code”, MEIS1 e MYB, mediante PCR semi-quantitativa Real Time, durante il differenziamento monocito-macrofagico indotto dal phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), in cellule THP-1 che possiedono la traslocazione t(9;11)(p22;q23) ed esprimono MLL-AF9. I risultati mostravano che tutti i geni analizzati erano espressi nelle cellule THP-1 non trattate. Dopo l’induzione del differenziamento, abbiamo osservato una down-regolazione di HOXA4, 7, 10, 11, MEIS1 e MYB, indicando che l’espressione di questi geni potrebbe essere implicata nel blocco del differenziamento osservato in leucemie relative a MLL-AF9. Poiché la chemioterapia standard non è curativa per molti pazienti con LAM-M5 con anormalità 11q23/MLL, abbiamo anche valutato gli effetti di diverse molecole, singole ed in combinazione, a concentrazioni clinicamente ottenibili, sul differenziamento lungo il lineage monocito-macrofagico, in linee cellulari di LAM-M5 con traslocazioni t(9;11)(p22;q23) e che esprimono MLL-AF9. I risultati indicavano che la combinazione di agenti demetilanti, come la decitabina, e molecole che inducono il differenziamento monocitico normale, come la Vitamina D3, aveva una forte attività anti-leucemica e si raccomandano ulteriori investigazioni di tale combinazione in questo tipo di neoplasia.; The translocation t(9;11)(p22;q23) generates the MLL-AF9 oncogene and is commonly associated with monocytic acute myeloid leukemia (AML-M5; FAB-classification). For the oncogenicity of MLL-AF9, the (over)expression of several other genes, including HOXA4, 5, 6, 7, 9, 10 and 11 (defined as “HOXA-code” genes), MEIS1 (a cofactor of “HOXA-code” proteins) and MYB is required. We previously showed that the down-regulation of MLL-AF9 expression is not obligatory for monocyte-macrophage maturation in AML-M5 cells carrying t(9;11)(p22;q23). In this study, we analyzed the expression patterns of “HOXA-code”, MEIS1 and MYB genes, by semiquantitative Real Time PCR means, during the monocyte-macrophage differentiation induced by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), in THP-1 cells carrying t(9;11)(p22;q23) and expressing MLL-AF9. The results showed that all the analyzed genes were expressed in untreated THP-1 cells. After the induction of differentiation, we observed a down-regulation of HOXA4, 7, 10, 11, MEIS1 and MYB, indicating that the expression of these genes could be implicated in the differentiation blockage observed in leukemias with 11q23/MLL abnormalities. Because standard chemotherapy is not curative for many patients with AML MLL-related, we also evaluated the effects of several molecules, alone or in combination, at clinically achievable concentrations, on differentiation along monocyte-macrophage lineage, in AML-M5 cell lines carrying t(9;11)(p22;q23) and expressing MLL-AF9. The results indicated that strategies combining demethylating agents, such as decitabine, and drugs that induce normal monocytic differentiation, such as Vitamin D3, had strong anti-leukemic activity and warrants further investigation in this type of malignancy. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1487 2009-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1485 Title: ApoJ/clusterina: un nuovo soppressore tumorale per il neuroblastoma Authors: Corvetta, Daisy Abstract: La clusterina e’ una proteina ubiquitaria il cui ruolo biologico e’ attualmente motivo di studio e discussione. Studi condotti da diversi gruppi di ricerca ne hanno evidenziato sia la overespressione che il silenziamento in differenti tumori umani. Definire un ruolo fisiologico per questa proteina risulta ulteriormente difficile in seguito a studi che la descrivono come promotore dell’apoptosi, della motilita’ cellulare e dell’ infiammazione. Il gene della clusterina codifica per diverse isoforme proteiche, quella citoplasmatica e quella nucleare, derivanti da uno stesso mRNA, in seguito a modificazioni post-traduzionali. Queste diverse isoforme sono implicate sia nel processo di sopravvivenza cellulare, sia in quello di morte cellulare. E’ possible che la scelta tra soppravvivenza cellulare e apoptosi sia strettamente correlata con la differente espressione di queste due isoforme, quella citoplasmatica e quella nucleare. Nel cancro, l’alterazione nel pattern d’espressione della clusterina e’ stato visto nella prostata, seno, pancreas, vescica ed esofago. Nel neuroblastoma, studi precedetemente condotti nel nostro laboratorio hanno evidenziato come la clusterina sia in grado di regolare negativamente l’oncoproteina NF-kB. Inoltre la delezione genetica di clusterina determina un’incremento dell’incidenza di neuroblastomi in modello murino. Recentemente e’ stato dimostrato che la clusterina, nel neuroblastoma, e’ negativamente e indirettamente regolata dal protooncogene MYCN attraverso l’attivazione del cluster miRNAs 17-92. MYCN e’ un fattore trascrizionale in grado di regolare direttamente o indirettamente l’espressione genetica dei suoi geni bersaglio. L’interazione indiretta avviene mediante il reclutamento di altre molecole quali HDAC o DNA metiltransferasi che , agendo a livello della struttura della cromatina, modulano l’espressione del gene bersaglio. MYCN agisce direttamente legandosi a specifiche sequenze consenso (E-BOX) presenti sul promotore del gene target. Il promotore della clusterina presenta diverse sequenze consenso target-specifiche per MYCN. L'alterazione delle strutture che riducono o aumentano l'accessibilità alla trascrizione e traduzione dei geni, si configura come un evento epigenetico che determina un'alterazione dell' equilibrio cellulare favorendo lo sviluppo di cellule tumorali. L'utilizzo di farmaci demetilanti e/o inibitori dell'istone deacetilasi sono in grado di riportare il livello d'espressione di ApoJ/clusterina a livelli normali in diversi tipi di linee celluari, comprese quelle di neuroblastoma.; Epigenetic reprogramming is an important mechanism of oncogene-induced tumourigenesis. MYCN, a neuronal specific member of the MYC family of transcription factors, is amplified and highly expressed in aggressive, metastatic neuroblastomas. In this study we show that MYCN inhibits the expression of CLUSTERIN (CLU), a potential tumour suppressor gene, by direct interaction with a non canonical E-box sequence in the 5’ flanking region of the CLU promoter. We found that binding of MYCN to the CLU gene causes the appearance of bivalent epigenetic marks, typically observed in the promoters of developmentally regulated genes in stem cells, such as acetylated histones H3/4, di-methylated H3K4 , tri-methylated H3K9-K27, and recruitment of histone deacetylases and polycomb proteins. Tricostatin A and Valproic acid, two inhibitors of histone deacetylases currently used in cancer clinical trials, re-activate the expression of CLU in MYCN amplified neuroblastoma cell lines, causing inhibition of their proliferation and invasive potential. Notably, the effects of the epigenetic drugs are completely abrogated when CLU expression is silenced by RNA interference. This is, to our knowledge, the first study documenting that a MYC oncoprotein can impose a bivalent state and negatively modulate a tumour suppressor gene by direct interaction with an E-box motif. The observation that CLU is an essential mediator of the therapeutic effects of histone deacetylase inhibitors in MYCN-driven tumours suggests that re-activation of CLU in cancer patients could be used to predict a favourable response to epigenetic drugs. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1485 2009-12-31T23:00:00Z