http://hdl.handle.net/1889/657 Wed, 19 Jun 2013 13:05:45 GMT 2013-06-19T13:05:45Z http://dspace-unipr.cilea.it:80/retrieve/1988/Nibbio.jpg http://hdl.handle.net/1889/657 http://hdl.handle.net/1889/2213 Title: Morphological, ultrastructural and immunohistochemical identification of cardiac lymphatic vessels and their functional role in cardiomyopathies Authors: Cavalli, Stefano Abstract: Il sistema linfatico consiste in una fitta rete di capillari e vasi che vanno a formare un circolo aperto e monodirezionale parallelo a quello sanguigno. Tra le sue più importanti funzioni figurano l’assorbimento degli acidi grassi ed il mantenimento dell’omeostasi tissutale mediante drenaggio di liquidi e proteine plasmatiche fuoriuscite dai capillari sanguigni nei tessuti. Il circolo linfatico, attraverso le stazioni linfonodali, svolge anche un ruolo determinante nel trasporto delle cellule immunitarie, garantendo la sorveglianza immunologica e permettendo alle cellule immunitarie di raggiungere velocemente il sito di danno. Lo studio della circolazione linfatica è sempre più importante in oncologia, visto il suo coinvolgimento nei meccanismi di migrazione delle cellule neoplastiche che portano allo sviluppo di metastasi. Lo studio dei vasi linfatici è stato per lungo tempo ostacolato dalla difficoltà nella loro identificazione e distinzione dai vasi sanguigni. La recente scoperta di marcatori come Podoplanina (PDPN), “lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1” (Lyve-1) e “Prospero- related homeobox 1”(Prox-1), che sono espressi specificamente in cellule endoteliali linfatiche, ha notevolmente favorito il loro studio istologico in tutti i distretti dell’organismo, compreso il cuore. Infatti, anche se la prima descrizione dei vasi linfatici nel cuore risale a circa tre secoli fa, solo di recente è stato rivalutato il loro ruolo sia nel mantenimento dell’omeostasi del tessuto interstiziale che in condizioni patologiche. Restano ancora da chiarire i meccanismi che regolano la linfangiogenesi a livello cardiaco ed i fattori di crescita coinvolti. Il più rilevante sistema di regolazione della linfangiogenesi si sviluppa sull’asse VEGF-C/VEGFR-3, ma anche altri fattori di crescita si sono dimostrati capaci di stimolare la crescita di vasi linfatici. Ad esempio il “Plateled derived growth factor” (PDGF) è un fattore di crescita da tempo conosciuto per la sua azione pro-angiogenica e il suo coinvolgimento nei meccanismi di reclutamento di cellule vascolari murali come i periciti. Recentemente è stata provata la sua importanza anche nell’induzione della linfangiogenesi tumorale. La prima fase di questo lavoro consiste nella caratterizzazione immunofenotipica, strutturale ed ultrastrutturale dei vasi linfatici in diversi organi umani e murini. Sezioni istologiche, ottenute sia da campioni autoptici umani che da organi isolati da modelli sperimentali, sono state analizzate tramite tecnica immunoistochimica in fluorescenza per verificare l’espressione dei più importanti markers linfatici. I markers risultati più specifici e maggiormente espressi sono quindi stati selezionati per valutare fenotipo, densità e distribuzione del sistema linfatico. La distribuzione dei vasi linfatici nel cuore umano e murino risulta simile. Questi si concentrano principalmente nelle regioni subepicardiche e negli spazi interstiziali che circondano arterie e vene. Un piccolo numero di capillari linfatici si ritrova nelle parti più profonde del muscolo cardiaco tra i cardiomiociti. La successiva analisi mediante microscopia elettronica ci ha permesso di analizzare le caratteristiche ultrastrutturali associate ai vasi linfatici, non facilmente rilevabili con altre metodiche. I vasi linfatici mostrano una parete molto sottile rispetto ai vasi sanguigni, una membrana basale assente o discontinua e frequenti interruzioni del monostrato endoteliale, conosciute come fenestrature. Un'ulteriore conferma della natura linfatica dei vasi analizzati è stata ottenuta tramite tecnica Immunogold con anticorpi specifici per il Lyve-1. Le tecniche precedentemente descritte ci hanno permesso di ottenere informazioni esclusivamente bidimensionali, mentre l’architettura vascolare all’interno dell’organo è tridimensionale. Per superare questo limite tecnico è stato quindi messa a punto una nuova tecnica, denominata micro-linfangiografia in fluorescenza. In seguito all’iniezione di due traccianti fluorescenti, l’intero spessore del ventricolo di ratto viene analizzato al microscopio confocale. La tecnica permette di ottenere ricostruzioni tridimensionali della rete di vasi linfatici all’interno dell’organo. Nella fase successiva del lavoro sono stati valutati gli aspetti funzionali del sistema linfatico cardiaco. Il tessuto cardiaco è stato analizzato sia nelle condizioni normali, sia nelle condizioni conseguenti allo sviluppo di diverse cardiomiopatie. Ognuna delle cardiomiopatie analizzate è scatenata da un diverso agente eziologico. Nella cardiomiopatia ipertrofica ostruttiva (HOCM) è la mutazione di geni codificanti per proteine sarcomeriche a determinare lo sviluppo di ipertrofia settale accompagnata da disfunzione diastolica. Il danno ischemico è invece la causa scatenante della più comune cardiomiopatia di origine estrinseca, ovvero l’infarto del miocardio (MI). La cardiotossicità risulta infine tra i principali effetti avversi conseguenti al trattamento con diversi farmaci antitumorali come Doxorubicina e Imatinib . Il primo farmaco fa parte della famiglia delle antracicline, e come tale determina un effetto cardiotossico ampiamenente studiato e conosciuto. L’Imatinib è invece un inibitore dei recettori tirosina-chinasici (TKI) e rappresenta uno dei più grandi successi della medicina per quel che riguarda la cura delle neoplasie, approvato per il trattamento della leucemia mieloide cronica e dei tumori gastrointestinali. Tra i principali target dell’IM figurano recettori di grande importanza per la regolazione dell’angiogenesi nonché della linfangiogenesi, come il c-kit, il PDGFR e il VEGFR-3. Lo studio di campioni derivanti da miectomie chirurgiche di pazienti affetti da HCM ha messo in evidenza una forte risposta linfangiogenica all’interno dell’organo. I risultati dell’analisi immunoistochimica indicano una sensibile riduzione del numero di capillari sanguigni, in termini di densità (numero di vasi per unità di area analizzata). Questa alterazione del letto vascolare sanguigno risulta semplice da giustificare se si tiene conto di quelle che sono le principali caratteristiche istomorfologiche della malattia, ovvero la fibrosi interstiziale, l’aumento della dimensione dei miociti ed il loro disarray. Il comportamento del sistema linfatico ha però un andamento completamente diverso. Si osserva un aumento marcato della densità dei vasi linfatici sia a livello dello spesso strato di tessuto fibrotico presente nel versante subendocardico, sia a livello dei tessuti muscolari cardiaci più profondi. L’aumento in termini di densità è accompagnato da un altrettanto marcato incremento dell’indice proliferativo che è stato misurato andando a quantificare i livelli di espressione nucleare di proteine specifiche del ciclo cellulare e della mitosi. Nella risposta dell’organo ad un insulto ischemico come l’infarto, è stato osservato un significativo aumento del numero dei vasi linfatici. Questo aumento risulta differito rispetto alla risposta angiogenica e funzionalmente associato alle diverse fasi di maturazione della cicatrice fibrotica. Anche nella cardiotossicità indotta da DOXO si registra un aumento di densità della componente linfatica associata alla marcata deposizione di collagene tipica di questa cardiopatia. Un comportamento completamente diverso si osserva invece nella cardiotossicità indotta da IM. Il cuore degli animali trattati con il farmaco mostra, in associazione ad una forte riduzione dei vasi linfatici, un aumento nel contenuto relativo di acqua. Il trattamento con il farmaco è quindi in grado di alterare la funzione di drenaggio del miocardio contribuendo allo sviluppo della disfunzione dell’organo. A livello ultrastrutturale, abbiamo inoltre potuto documentare in microscopia elettronica un’estesa compromissione dei mitocondri nei vasi sanguigni e linfatici. In conclusione i dati ottenuti dimostrano che, in ognuna delle condizioni patologiche analizzate, il sistema linfatico risulta importante nella risposta del cuore ai diversi insulti subiti ed assume un ruolo determinante per il suo rimodellamento. L’interferenza nei meccanismi linfangiogenici può determinare un’alterazione dell’omeostasi tissutale e quindi contribuire negativamente allo sviluppo di cardiopatie Thu, 11 Apr 2013 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2213 2013-04-11T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2212 Title: Modelli sperimentali e nuovi target per la terapia della BPCO: indagine sul ruolo delle isoforme gamma e delta di PI3K Authors: Pisano, Anna Rita Abstract: La BPCO è caratterizzata da una risposta infiammatoria cronica associata ad una limitazione irreversibile del flusso d’aria nelle vie aeree. È noto come l’esposizione a fumo di sigaretta sia la causa più comune di insorgenza di BPCO (Rabe et al, 2007) e come l’infiammazione che guida la progressione di questa patologia sia scarsamente sensibile all’effetto dei corticosteroidi (Barnes NC et al, 2006). La cessazione del fumo di sigaretta, associato all’uso di broncodilatatori e di farmaci antiinfiammatori di tipo steroideo, non costituisce una terapia sufficiente per frenare la progressione della malattia. Per questo motivo le industrie farmaceutiche stanno cercando di sviluppare nuovi farmaci antiinfiammatori capaci di ridurre non solo le resistenze al flusso d’aria, ma soprattutto di prevenire il processo infiammatorio alla base della BPCO. Dal momento che il fumo di sigaretta costituisce il principale agente eziologico responsabile dell’instaurarsi della BPCO, modelli animali di esposizione al fumo di sigaretta consentono di esplorare i meccanismi che stanno alla base dell’instaurarsi della patologia e di testare l’efficacia di nuovi potenziali farmaci antiinfiammatori . Lo scopo dello studio, condotto presso il Dipartimento di Farmacologia della Chiesi Farmaceutici S.p.A nel primo e nel secondo anno di dottorato, è stata la messa a punto e la caratterizzazione di un modello di infiammazione polmonare indotta dall’esposizione acuta al fumo di sigaretta nel topo. Il modello sperimentale da noi allestito prevede l’esposizione al fumo di sigaretta di topi C57BL/6J mediante un sistema di inalazione “nose only“. Tale modello è stato utilizzato per la valutazione dell’effetto di farmaci antiinfiammatori con diverso meccanismo d’azione e diverse vie di somministrazione: in particolare sono stati testati il composto roflumilast (orale) e GSK256066 (inalatorio) ad attività inibitoria sull’enzima PDE4, e budesonide, un composto appartenente alla classe dei corticosteroidi. In questo modello è stato possibile osservare la resistenza agli steroidi tipica della BPCO e indagare il ruolo delle fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3Ks) in tale fenomeno, con particolare riferimento alla capacità di inibitori di PI3K di ripristinare l’effetto anti-infiammatorio degli steroidi. Questo modello è stato anche usato per valutare il ruolo dell’isoforma gamma di PI3K nell’infiammazione, grazie alla possibilità di usare topi geneticamente modificati con inattivazione costitutiva di PI3Kγ. Nel corso del terzo anno di dottorato, lo scopo dello studio condotto presso il Dipartimento di Biotecnologie Molecolari dell’Università di Torino (MBC), è stato l’approfondimento del target PI3Kγ con particolare attenzione al ruolo di PI3Kγ nei meccanismi di contrazione e rilassamento del muscolo liscio delle vie aeree, allo scopo di identificare possibili meccanismi che leghino l’infiammazione alla progressiva perdita di funzionalità respiratoria osservata nella BPCO. Mon, 31 Dec 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2212 2012-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2194 Title: Motor, Social and Cognitive Development in Infant Rhesus Macaques (Macaca mulatta) Authors: Sclafani, Valentina Abstract: Motor cognition develops from a mutual and functional relation between perception and action. Several studies have demonstrated that, by a action-perception matching system, we represent observed and executed actions in a corresponding manner (Jeannerod, 2001; Knoblich & Flach, 2003; Gallese, Keyser & Rizzolatti, 2004: Jackson & Decety, 2004). Electrophysiological research has demonstrated that specific neurons, called mirror neurons, found in two areas of the primate brain (ventral premotor cortex and superior temporal sulcus) are selectively activated during the observation of actions executed by conspecifics (di Pellegrino et al. 1992; Gallese et al. 1996; Rizzolatti, Fadiga, Fogassi, & Gallese, 1996), providing evidence that such an observation–execution matching is involved in our ability to recognize and understand the actions of others. Since shared representations relies on a common computational code and neural architecture, our aim was to explore two different aspects of motor cognition, such as organization of actions and imitation of the others actions. In Experiment 1, we investigated the emergence and the development of prehensile skills in infant macaques over the first month of life, to better understand how infants construct a motor representation of actions in relation to the task and environmental constraints. We found that our infants showed clear goal-directed movements towards the object as early as the second week of life and that their flexibility and selectivity of motor responses improved remarkably with age. Our data also showed that infant macaques were able to adjust their actions in relation to the perceived object size and organize their reaching-grasping responses accordingly. The intent of Experiment 2 was to explore the development of spatial perception and representation in infants and their ability to modulate actions when the object was placed in the near and far space and how infants construct a map of surrounding world in relation to the representation of their own body. The results revealed that monkey infants gradually improved their capability to perceive objects at a certain distance and direction in space, and thus to use this information in order to plan different motor strategies and to adjust the hand configuration accordingly. Infants seemed to code the peripersonal space in a arm-centered coordinate system since the onset of a successful reaching. In contrast, starting from the third week of life, infants started to move physically toward the object and to use their own body as a tool to expand their peripersonal space. By including the body in the action, infants induced changes in the body schema and expanded near space representation in a body-centered coordinate system. These changes in the reaching strategy used by the infants probably reflected an improvement in their capacity to move the whole body and to coordinate more precise movements. Furthermore, our data showed that changes in body schema can influence also infants’ perception of object in space and their flexibility in choosing a different grip configuration according to the size and the position in space of the target. Taken together, these findings suggest that several brain mechanisms of intermodal integration between visual proprioceptive information and motor movements might be already formed after birth, although only broadly defined, and that sensori-motor experience and learning might help infant to sequentially and successfully acquire new motor capabilities. The emergence of such visuo–motor integration may account also for the match between visual input and motor output in imitation tasks. The ability to recognize to be imitated requires the existence of a matching mechanism between visual and proprioceptive information. To this aim, in Experiment 3 we investigated the development of the infants ability to recognize when they were being imitated and the effect of imitiation on affiliation and social interaction. This experiment demonstrated that imitation can significantly affect the behavior of the infant monkeys and facilitate an affective connection with the caregiver: infants, in fact, looked longer and lipsmacked more at the experimenter both during the imitation and after being imitated. These results demonstrate that from early in life imitation might be used as a privileged form of communication which provides essential social inputs for the maturation of the infant’s relational and social skills. Moreover, our data suggest the existence of an early functioning recognition mechanism, possibly based on a mirror neurons system. Wed, 13 Mar 2013 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2194 2013-03-13T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2192 Title: Analisi del fenotipo comportamentale e metabolico di una linea di topo con inattivazione condizionale del gene NPY-1R Authors: Panelli, Riccardo Abstract: Npy è il neuropeptide più diffuso nel Snc mammifero ed è implicato nella regolazione di molteplici funzioni, metaboliche e cognitive, dal consumo di etanolo, all'ansia, alla depressione, all' omeaostasi energetica. In questa tesi è presentato tutto il lavoro svolto nell'ottica di caratterizzare sia a livello metabolico che comportamentale un modello di topo con una delezione condizionale del gene per uno dei 5 sottotipi recettoriali mediante cui Npy esercita i suoi effetti. Wed, 13 Mar 2013 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2192 2013-03-13T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2191 Title: Communication, Emotional Contagion and post-conflict third party interaction in geladas (Theropithecus gelada) Authors: Leone, Alessia Abstract: In literature, empathy has been characterized by a disagreement regarding the exact nature of the phenomenon. There are emotional, cognitive, and conditioning views of empathy, and these views apply to different extents across species. These forms of emotional linkage support group alarm, vicariousness of emotions, mother-infant responsiveness, and the modelling of competitors and predators; these forms have profound effects on reproductive success. Taking into account the possible mechanisms underlying gelada’s spontaneous yawn, emotional contagion and emotional response to conflicts between other group members, our results provide information which can have important theoretical implications. In fact, our findings are consistent with the view that contagious yawning reveals an emotional connection between individuals and also that empathy could be one of the mechanisms involved in triadic post-conflict affiliation. We recorded the behaviours of individual belonging to two colonies of geladas, (Theropithecus gelada), a species characterized by a female-centred one-male society, living at the NaturZoo (Rheine, Germany). Data were collected during a 6-month period in 2007 (June-November), a 4-month period in 2009 (June-September), a 2-month period in 2010 (July-August) and a 2-month period in 2011 (July-August). The gelada is a good model species because they have a strong sexual dimorphism, a clear-cut linear hierarchy, high social cohesiveness and fine-tuning towards companions. In the first study, we focussed on some social hypotheses on the potential functions of spontaneous yawning according to its patterns and contexts. Geladas, perform yawning according to three different visual intensity modalities, which are easy to be detected due to the diverse degree of mouth opening. We investigated whether the patterns of the yawn performance is predictive of its potential functions. YW1, YW2, and YW3 can transmit different meanings according to the performer, the context and the behavioural pattern temporally associated to the yawn event. Moreover scratching, used as a reliable measure of anxiety, increased after each yawning type, even though the subjects tended to scratch themselves more after YW3, thus suggesting that this type of yawn can indicate an even higher variation of arousal. All the three types of yawning were more frequent in the early morning with YW3 also showing an additional daily peak (pre-feeding). Even though a clear cut functional distinction of the diverse types of gelada yawns is complicated, we suggest that YW1 and YW2, being more linked to an emotional internal state, can be considered "true" yawns and YW3 can function as a multimodal signal which can be more modulated and affected by external social events. In the second study we assessed that in gelada baboons yawning is contagious, especially between socially close individuals; in fact, the contagiousness of yawning correlated with the level of grooming between subjects. Adult females showed precise matching of different yawning types, which suggests a mirroring mechanism that activates shared representations. We suggested that females have an enhanced sensitivity and emotional tuning toward companions compared to males. In the third study, we tested some hypotheses on the potential functions of triadic affiliation in geladas. We enlightened that the positive outcome of the triadic post-conflict affiliation is focussed more on victims than on bystanders (Self-Protection Hypothesis) or other group members (Tension Reduction Hypothesis), which apparently do not gain any kind of benefits by the behaviour. Moreover, it seems that triadic post-conflict affiliation does not have a role in restoring relationships between former opponents (Substitute for Reconciliation Hypothesis), so that reconciliation and triadic post-conflict affiliation co-exist and co-cooperate for two different purposes. After conflicts of high intensity levels, triadic affiliation improves the emotional state of the victim (Consolation Hypothesis) by lowering his/her levels of anxiety, especially when the victim is a kin or a close-bonded partner. In this case, a stronger emotional response can be elicited in the third-party which directs a higher frequency of affinitive acts towards the victim as predicted by the sympathetic concern hypothesis already suggested for humans and apes. As a whole, our findings indicate that two of the multiple levels of empathy described in literature for humans and apes (emotional contagion and sympathetic concern) are probably present in monkeys as well. Wed, 13 Mar 2013 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2191 2013-03-13T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2190 Title: Aspergillus flavus: controllo della biosintesi di aflatossina e strategie di biocompetizione Authors: Degola, Francesca Abstract: L'aflatossina B1 è considerata una delle micotossine più pericolose per la salute dell'uomo e degli animali. La contaminazione di alimenti e mangimi che può verificarsi, a seguito dell’infezione fungina, in ogni fase del loro processo di trasformazione (dal campo alla tavola) è causa di gravi perdite economiche. Una delle strategie che attualmente è considerata tra le più promettenti nel contenere il "rischio aflatossine" consiste nell’uso della bio-competizione quale mezzo di prevenzione dell'infezione fungina delle colture in campo. Il biocontrollo realizzato tramite l’inibizione competitiva ad opera di ceppi atossigenici (afla-) di Aspergillus flavus ha dimostrato di essere un metodo efficace per il contenimento aflatossine in arachidi, mais e semi di cotone. Le popolazioni naturali di afla- sono considerate i serbatoi da cui selezionare i biocompetitori più forti; tuttavia, selezionare i ceppi migliori non è facile, sia per la scarsità di ceppi afla- efficaci che per le diverse condizioni ambientali che possono influenzare la loro efficacia in campo. Occorrono pertanto procedure “high throughput” in grado di vagliare un numero molto elevato di isolati per identificare i buoni competitori. Le prove in campo necessarie per valutare la loro efficienza una volta rilasciati nell’ambiente sono costose e laboriose, ma esperimenti di ricostruzione condotti in laboratorio possono essere utili sia per analizzare i meccanismi biologici alla base dell'efficacia dei ceppi afla- nel prevenire la biosintesi di aflatossina, sia per ottenere indicazioni preliminari sulle prestazioni degli stessi sulle colture. In questo lavoro è stata messa a punto una procedura semplice ed economica, che sfrutta fluorescenza UV-indotta della tossina, per valutare il potenziale di ceppi afla-, che colonizzano i campi di mais della pianura padana, nel ridurre l'accumulo di aflatossina; attraverso il processo di screening è stato isolato un ceppo afla- che si è dimostrato efficace nel contenere l’accumulo di aflatossina nei confronti di tutti i ceppi aflatossigenici (afla+) isolati. Il profilo genetico del buon competitore è stato caratterizzato, e la sua efficacia testata in campo nel corso di un trial di tre anni. Sono stati analizzati alcuni dei parametri che si sospetta siano coinvolti nell'efficacia della biocompetizione: i dati riportati dimostrano che sia il momento di inoculo del ceppo afla- che il rapporto tra afla- e afla+ sono cruciali. L'effetto della concentrazione dei conidi è stato invece valutato con esperimenti in micromanipolazione in cui spore singole afla- e afla+ sono state inoculate fianco a fianco sulla superficie di terreno agarizzato. La procedur, che si avvale di un lettore di fluorescenza di piastre multipozzetto, è stata utilizzata anche per valutare l'efficacia e la cinetica di azione di composti antiossidanti (o di miscele) sull'accumulo aflatossine: è stato testato l’effetto sia di composti puri (come acido α-lipoico, acido ascorbico e N-acetil-cisteina), sia di estratti vegetali (estratti organici di radici, stelo e foglia di Citrullus colocynthis), sia di estratti naturali commerciali (estratto di semi d’uva e di Ratania, Indena®). Infine, è stata dimostrata l'efficacia biocompetitiva di un ceppo naturale di Aspergillus oryzae, isolato da mais campionato in Madagascar, contro ceppi aflatossigenici di A. flavus.; Aflatoxin B1 is considered one of the most dangerous mycotoxin for humans and animals health. Moreover severe economic losses may be encountered due to its possible contamination of food and feed during each step of their transformation process (from field to table). Preventing fungal infection/ toxin contamination of crops in the field is considered the preferred strategy to cope with the “aflatoxin risk”. Biocontrol by competitive inhibition using atoxigenic (afla–) Aspergillus flavus strains has been shown to be an effective method in aflatoxin containment in peanuts, maize and cottonseed. Naturally occurring populations of afla– strains are considered reservoirs from which to select the strongest biocompetitors. However, the selection of biocontrol strains is not an easy task, due both to the small amount of afla– strains and to the various environmental conditions that may affect their efficacy in the field. High throughput procedures are therefore desirable to screen large amount of isolates in order to identify “good competitors”. Moreover, as field trials required to assess their efficiency are expensive and laborious, reconstruction experiments have been generally performed under laboratory conditions to investigate the biological mechanisms underlying the efficacy of afla– strains in preventing aflatoxin production and/or to give a preliminary indication of strain performance when released in the crops. Here, a simple and inexpensive fluorescence-based procedure is described: this is used to evaluate the potential of afla– strains, colonizing the corn fields of the Po Valley, in reducing aflatoxin accumulation; through the screening process an afla- strain is found to be a good competitor against all aflatoxigenic (afla+) strains isolated. The “good competitor” has been genetically characterized and his efficacy tested on crops during a three-years trial. We also analyzed some parameters for the competition efficacy: the data we reported showed that both the timing of afla– inoculation and the inoculum ratio between afla– and afla+ strains are crucial. The effect of conidia “crowding” was assessed with experiments performed by co-inoculation of spore suspensions or single spores of afla– and afla+ strains side by side on the surface of CAM plates. The fluorescence-based procedure is here also used to assess the efficacy and the time-course effect of antioxidants (or multiple combination of them) on aflatoxins accumulation: pure compounds (such as α-lipoic acid, ascorbic acid and N-acetyl-cysteine), botanicals (Citrullus colocynthis organic extracts from roots, stems and leaves tissues) and commercial standardized natural extracts (Indena® Ratania and grape seeds extracts) are tested. Moreover, we demonstrated the biocompetitive efficacy of an Aspergillus oryzae wild strain, isolated from maize commodities collected in Madagascar, against aflatoxigenic A. flavus strains: competition tests both with multiwell procedure and on maize kernels were conducted. Sun, 31 Mar 2013 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2190 2013-03-31T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2187 Title: Role of proteoglycans and glycosaminoglycans in tumorigenesis Authors: D'Angelo, Alessandra Abstract: La variabilità strutturale e funzionale dei proteoglicani (PGs) è alla base della loro fondamentale importanza biologica nei processi di sviluppo, nella vita adulta e in diverse condizioni patologiche come il cancro. I proteoglicani sono coinvolti in diversi processi cellulari grazie alla loro capacità di legare, modulandone l’attività, diversi fattori del crescita. Tra tutti i proteoglicani, i glipicani (GPCs) sono indicati sia come molecole tumore-associate sia come soppressori tumorali e la loro funzione sembra essere fortemente collegata con il fenotipo di tumore. I nostri studi si sono concentrati su un particolare glipicano, il glipicano 5 (GPC5), in un particolare fenotipo di tumore delle parti molli, l’osteosarcoma umano. I nostri dati supportano l’ipotesi che il glipicano 5 possa essere considerato come un soppressore della tumorigenesi in questi particolari fenotipi tumorali, agendo sia sulla proliferazione delle cellule tumorali sia sulla loro motilità. I glicosaminoglicani (GAGs) partecipano a molti dei processi biologici influenzati dai proteoglicani e la loro complessità funzionale è in parte correlata con le loro caratteristiche strutturali e chimiche. Per questa ragione abbiamo ritenuto opportuno studiare approfonditamente due particolari strutture glicosaminoglicaniche, catene di eparan solfato ad alta solfatazione e catene di cheratan solfato caratterizzate da una particolare struttura chimica. Questi studi sono stati condotti per mezzo della tecnica degli anticorpi monoclonali. Il nostro scopo ultimo è quello di tracciare la correlazione esistente tra struttura chimica di queste molecole e loro distribuzione nei tessuti umani. Questi studi rappresentano passi importanti nella comprensione profonda della relazione tra struttura e funzione dei proteoglicani che potrebbe rendere queste molecole degli interessanti bersagli terapeutici in diverse condizioni patologiche.; Structural-functional diversity of proteoglycans (PGs) is the pivot of their biological importance during the embryonic development, in the adult and also in pathological conditions such as cancer. PGs may be involved in different cell behavior by binding and modulating a broad spectrum of growth factors. In particular, among PGs, glypicans (GPCs) are listed as both tumor-inhibitors and promoters and seems to be closely tumor-type specific. Our study on glypican 5 (GPC5) in a particular soft tissue sarcoma, human osteosarcoma, support the hypothesis that this molecule may be considered as a tumor-suppressor, inhibiting cancer cell growth and motility. Glycosaminoglycans (GAG) participate to many of the PG biological processes and their functional complexity is in part due to their structural and chemical characteristics. For this reason we decided to investigate two particular GAG chains, highly sulfated heparin sulfate moieties and a specific keratan sulfate structure, using the monoclonal antibody technique. Our goal is to understand the correlation between the chemical structures of these moieties and their distribution in the human adult tissues. These may be the first steps in the comprehension of the structural-functional relationship of PGs that could be considered as an attractive target for therapeutic intervention in different pathological conditions. Thu, 11 Apr 2013 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2187 2013-04-11T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2183 Title: Role of technology in the management of diabetes care: METABO as a support tool Authors: Banchini, Carlotta Abstract: The aim of Metabo is to set up a comprehensive platform for continuous and multi-parametric monitoring of the metabolic status in patients with diabetes and associated metabolicic disorders. The data produced by Metabo will be integrated with the clinical data and history of the patient and will be used for: 1-setting up a dynamic model of the metabolic behavior of the individual to predict the influence and relative impact of specific treatments and of single parameters on glucose level. 2- Building personalized care plans integrated in the current clinical processes improving the active role of the patient. Mon, 31 Dec 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2183 2012-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2181 Title: Structural and functional characterization of vascular phenotype in lung cancer Authors: Madeddu, Denise Abstract: La crescita e lo sviluppo dei tumori solidi è dipendente dalla presenza di un adeguato supporto vascolare senza il quale il tumore rimane inattivo e incapace di metastatizzare. Il ruolo dell'angiogenesi nella progressione dei tumori polmonari è stato largamente descritto e molte strategie terapeutiche hanno come obiettivo l’inibizione del processo angiogenico. Scopo di questo studio è stata la valutazione, a livello tissutale, della presenza di riarrangiamenti strutturali dei vasi sanguigni e linfatici nel carcinoma polmonare umano. E’ stata inoltre studiata l'incidenza di cellule progenitrici vascolari riconosciute attraverso l’espressione del recettore di PDGF. Inoltre, abbiamo espanso in vitro popolazioni di cellule endoteliali ematiche e linfatiche ottenute dalle porzioni distale e neoplastica di polmoni, allo scopo di caratterizzare fenotipi vascolari anche dal punto di vista funzionale. Lo studio è stato condotto su 13 pazienti affetti da carcinoma polmonare e su dodici polmoni di pazienti in cui non era stata documentata alcuna patologia a carico del polmone, utilizzati come controllo (CTRL). Sul tessuto polmonare, utilizzato sia per isolamento cellulare che per la valutazione istologica, è stata effettuata un'analisi morfometrica ed immunoistochimica. Le porzioni tumorale (T) e distale (Dist) sono state considerate separatamente. Abbiamo potuto documentare una maggiore incidenza delle strutture vascolari (capillari e arteriole) nella porzione tumorale, sia rispetto alla porzione distale che rispetto ai campioni di controllo. Inoltre, la distribuzione di cellule progenitrici vascolari è risultata essere significativamente modificata nei campioni patologici. In particolare, i dati hanno mostrato una significativa deplezione di cellule PDGFRpos nelle porzioni distali mentre la loro incidenza era notevolmente aumentata nell'area neoplastica. Cellule endoteliali ematiche (BEC) e linfatiche (LEC) sono state caratterizzate mediante immunocitochimica. Abbiamo valutato sia l'espressione dei marcatori endoteliali che la presenza di recettori tirosin-chinasici (VEGFR2, VEGFR3, PDGFR). Su queste popolazioni cellulari sono state valutate anche la capacità angiogenica e migratoria mediante saggi funzionali in vitro. Il nostro studio può avere diverse implicazioni. Primo, l'alterazione strutturale e i cambiamenti nella distribuzione delle strutture vascolari possono rappresentare un potenziale indice prognostico del carcinoma polmonare. Inoltre, la nostra capacità di isolare le cellule endoteliali umane polmonari neoplastiche e normali può rappresentare un punto di partenza per studi finalizzati allo sviluppo di specifiche strategie terapeutiche mirate ad interferire con il microambiente tumorale.; The growth and development of solid tumors is critically dependent on a functional vascular supply in the absence of which tumors remain dormant and unable to metastasize. As with all solid tumors, the role of angiogenesis is well established in the progression of lung cancers and the development of new therapeutic strategies designed to inhibit tumor-induced angiogenesis should prevent the tumor growth and metastasis holding great promise for the advancement of lung cancer management. The aim of the present study was to characterize at tissue level the structural rearrangements of blood and lymphatic vessels in human lung cancer. The incidence of vascular progenitor cells through the evaluation of PDGF- receptor expression was also investigated. In addition, we expanded in vitro Hematic and Lymphatic endothelial cell populations from normal and neoplastic human lungs in order to characterize vascular phenotypes and to evaluate their functional properties. The study was performed on 13 patients affected by lung cancer and on twelve lungs from patients lacking pathologic states used as control (CTRL). On lung tissue, utilized both for cell isolation and histologic assessment, was performed morphometric and immunohistochemical analysis, sharing samples in tumoral portion (T) and distal area (Dist). We could document an increased incidence of vascular structures (capillaries and arterioles) in tumor area, when compared to the distal portion and to control samples. Moreover, vascular progenitor cell distribution was significantly altered in pathologic samples. In particular, our data showed that in distal portions there was a significative depletion of PDGFRpos cells, on the other hand their incidence was markedly increased within the neoplastic area. Hematic (BEC) and Lymphatic Endothelial Cells (LEC) were characterized by immunocytochemistry. We evaluated the expression of endothelial marker and we also assessed the presence of Tyrosine Kinase Receptors (i.e. VEGFR2, VEGFR3, PDGFR). The angiogenic and migration abilities of endothelial cell population were also investigated. Our results may open new prospectives in the development of new therapeutic strategies designed to interfere with tumor microenvironment which plays an important role in cancer growth, since the vascular niche supports the proliferation of neoplastic cells. Thu, 11 Apr 2013 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2181 2013-04-11T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/2180 Title: Effetti indotti in vitro dall'inibitore delle tirosina chinasi Imatinib mesylate su cellule staminali cardiache Authors: Galati, Serena Abstract: Gli effetti cardiotossici di alcuni farmaci antiblastici di vecchia generazione rappresentano tuttora una problema aperto nella chemioterapia oncologica. In questo contesto assume sempre più importanza l’introduzione sul mercato di nuovi chemioterapici disegnati per interagire con elevata specificità con proteine fondamentali per la tumorigenesi e quindi in grado di ridurre al minimo gli effetti di tossicità sulle cellule sane (targeted therapies). La prospettive di vita di pazienti affetti da leucemia mieloide cronica, leucemia linfoblastica acuta e da tumore stromale gastrointestinale è stata migliorata dall’introduzione di un inibitore delle tirosina chinasi cellulari, Imatinib mesylate, oggetto di questo studio. Nonostante l’indiscussa efficienza di questo farmaco, sta lentamente avanzando l’ipotesi che questa molecola possa avere effetti collaterali negativi sul sistema cardiocircolatorio. In particolare la possibilità che questo farmaco possa compromettere l’integrità delle cellule staminali e la loro capacità di rimpiazzare il tessuto danneggiato aumenta la probabilità di sviluppo di patologie cardiovascolari. Per questo motivo in questo studio sono state utilizzate cellule staminali di origine cardiaca: progenitori cardiaci di ratto (CPCs) e cellule staminali mesenchimali cardiache di origine umana (C-MSCs). Su queste linee cellulari sono state valutate la citotossicità, la genotossicità, l’attivazione del pathway autofagico e l’induzione di stress ossidativo. È stata inoltre condotta una comparazione degli effetti indotti su cellule staminali cardiache da IM con quelli dovuti al trattamento con un chemioterapico di vecchia generazione, la doxorubicina, nota per indurre tossicità cardiaca in soggetti esposti. Gli effetti indotti da questi due farmaci sono stati, inoltre, valutati sulle rispettive linee cellulari target, le K562 (linea cellulare di leucemia mieloide cronica) per IM e le MCF7 (linea cellulare di adenocarcinoma mammario) per la doxorubicina. I dati riportati in questa tesi mettono in luce che il trattamento in vitro con IM può indurre tossicità non solo in cellule target, ma anche in linee cellulari non- target. Inoltre, la comparazione con la risposta cellulare indotta dal trattamento con Doxorubicina ha confermato la maggiore specificità d’azione di IM. Allo stesso tempo si è evidenziato che un’alta concentrazione di IM, come quella che potrebbe risultare da un trattamento cronico, può indurre nelle cellule staminali cardiache una tossicità comparabile con quella osservata nelle stesse cellule trattate con Doxorubicina. Dato il crescente interesse nei confronti del pathway autofagico, come meccanismo di risposta cellulare indotto in seguito a trattamento con chemioterapici, sono stati condotti saggi al fine di comprendere il coinvolgimento di questo pathway nella risposta al trattamento con IM. Si è cercato inoltre di verificare se la modulazione della risposta autofagica potesse diminuire la tossicità indotta in cellule non- target senza compromettere l’efficacia del farmaco stesso.; Cardiotoxic effects of some old generation antiblastic drugs represent an actual problem in oncologic chemotherapy. In this context it seems fundamental to introduce new chemotherapics drawn to interact with high specificity with essential proteins in tumorigenesis, decreasing toxicity in health cells (targeted therapies). The life expectancy in chronic myeloid leukemia, acute linphoblastic leukemia and gastrointestinal stromal tumor patients has been improved after the introduction of a tyrosine kinase inhibitor, Imatinib mesylate, object of this study. Despite of the effectiveness of this drug, it is advancing the hypothesis that this molecule could have side effects on cardiovascular system. In particular, this drug could compromise the integrity of cardiac stem cells and their capability to replace damaged tissues, increasing the incidence of cardiovascular diseases. In this study we used cardiac stem cells: rat cardiac progenitor cells (CPCs) and human cardiac mesenchimal stem cells (C-MSCs). Cytotoxicity, genotoxicity, autophagy activation and oxidative stress induction have been evaluated. Doxorubicin, an old generation chemotherapy, has been used to compare in vitro effects induced by IM treatment with those induced by a drug with known cardiotoxic effects. Furthermore the effects induced by IM and Doxorubicin have been evaluated on their target cell lines, K562 (chronic myelogenous leukemia cell line) for IM, and MCF7 (breast adenocarcinoma cell line) for Doxorubicin. Data reported in this thesis underline IM toxicity induction in target and non- target cell lines. Furthermore comparison with cellular response induced by Doxorubicin confirms the higher specificity of IM. On the other hand it shows that an high IM concentration, that could result from a chronic treatment, could induce in cardiac stem cells a toxicity comparable with that observed in the same cell lines treated with Doxorubicin. Given the increasing interest in autophagy, as cellular response pathway induced by chemotherapic treatment, assays have been performed to understand the role of this pathway in IM treated cell lines. Furthermore we have verified if autophagy modulation could decrease toxicity induced in non- target cell lines without affecting the drug efficacy. Mon, 31 Dec 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/2180 2012-12-31T23:00:00Z