http://hdl.handle.net/1889/640 Wed, 22 May 2013 14:31:35 GMT 2013-05-22T14:31:35Z http://dspace-unipr.cilea.it:80/retrieve/1985/cascina.jpg http://hdl.handle.net/1889/640 http://hdl.handle.net/1889/1978 Title: Metodi molecolari per la rilevazione di microrganismi negli alimenti e nell'ambiente Authors: Bortolazzi, Laura Abstract: Il ruolo dei microrganismi nella biosfera è di inestimabile importanza. Hanno conquistato tutte le possibili nicchie ecologiche e svolgono un ruolo primario, contribuendo come primi attori al ciclo degli elementi essenziali per la vita. I microrganismi sono anche una fonte di nutrienti, essendo alla base di tutte le catene alimentari ed ecologiche. La scienza biotecnologica moderna e le sue applicazioni si basano sulle proprietà microbiche e sull’impiego dei microrganismi e dei loro processi per scopi specifici e industriali. Anche se la maggior parte di essi apporta benefici all’uomo, in determinate situazioni essi possono provocare danni agli organismi viventi superiori. Per tutti questi motivi la microbiologia diagnostica, che si occupa dell’identificazione e della rilevazione dei microrganismi, riveste un ruolo sempre più importante. E’ noto ormai da tempo che i metodi classici non sono sufficienti a tale scopo, infatti per quanto siano stati studiati terreni di isolamento e arricchimento per i diversi microrganismi coinvolti nelle diverse vie metaboliche, solo una frazione di tali soggetti può essere coltivata in laboratorio e i tempi di analisi sono spesso lunghi. Lo scopo di questa tesi è stato mettere a punto tecniche molecolari per la rilevazione di batteri conosciuti e metodi di studio di comunità microbiche in un ambiente complesso, valutandone l’efficacia e la possibile applicazione reale. Due sono i casi presi in esame: - Salmonella enterica e Campylobacter jejuni nella carne di pollo; - la consistenza e la diversità della comunità microbica di sedimenti di un sistema fluviale eutrofico, in presenza-assenza della macrofita radicata Vallisneria spiralis. Salmonella enterica e Campylobacter jejuni sono microrganismi contaminanti la carne di pollo in grado di causare infezioni alimentari all’uomo, che può venirne a contatto per ingestione di materiale contaminato. L’EFSA (European Food Safety Authority) negli ultimi anni ha intensificato gli studi e le pubblicazioni relative a tali microrganismi patogeni, controllando l’insorgenza delle zoonosi e cercando di mettere a punto sistemi per lo sviluppo di metodi diagnostici per il loro rilevamento negli alimenti. Sulla base di queste indicazioni, nella prima fase del lavoro di tesi sono stati sviluppati e analizzati due metodi per identificare e quantificare S. enterica e C. jejuni, pollo basati su PCR Real Time, qualitativa e quantitativa (qPCR) in colture microbiche pure ed in campioni di pollo. Poiché i geni target sono presenti in singola copia nei rispettivi batteri, è stato assunto che ad ogni copia di amplicone corrispondesse un singolo cromosoma e, di conseguenza, una singola cellula batterica. Il primo metodo, messo a punto in precedenza nella Sezione di Genetica e Biotecnologie Ambientali del Dipartimento di Scienze Ambientali dell’Università di Parma, si basa sulla chimica del SYBR®Green e, in questo lavoro, è stato testato in un laboratorio diverso da quello originale e su macchine per Real Time PCR di marche diverse da quella su cui il metodo era stato messo a punto originariamente. La riproducibilità dei dati ottenuti dalle diverse macchine è stata valutata mediante il calcolo della deviazione standard relativa (RSDR), secondo le indicazioni del CODEX alimentarius e tramite. l’analisi della varianza. Il metodo per la quantificazione di Salmonella in campioni di pollo contaminati artificialmente con questo organismo, si è rivelato trasferibile da una macchina all'altra, anche se ad operare erano sperimentatori diversi. Per Campylobacter, invece, il metodo deve essere ulteriormente migliorato, in quanto solo uno dei campioni analizzati dava risultati riproducibili sulle due macchine utilizzate. Tuttavia, lo stesso metodo, provato presso una delle aziende leader nel campo della produzione e distribuzione di diversi prodotti di carne avicola, si è rivelato adeguato per la rilevazione qualitativa di Campylobacter. L’altro metodo per la rilevazione e la quantificazione di S .enterica e C. jejuni è stato messo a punto utilizzando le sonde TaqMan®, che, oltre a presentare una maggiore specificità rispetto al SYBR®Green, consentono di quantificare contemporaneamente due DNA target nella stessa reazione. I risultati delle analisi, condotte su colture pure dei due microrganismi e su campioni di pollo contaminati con essi, hanno mostrato una buona concordanza tra la qPCR in singolo ed in doppio e i convenzionali metodi microbiologici, per la maggior parte dei campioni analizzati, con un limite di rilevabilità pari a 103 CFU per campione in entrambi i casi. Nella seconda parte di questa tesi sono riportati i risultati di uno studio preliminare sulla consistenza e la diversità della comunità microbica del sedimento in un sistema fluviale eutrofico, in presenza o assenza della macrofita radicata V. spiralis. Lo scopo di questo lavoro è stato sviluppare degli strumenti di analisi che permettano di comprendere il ruolo della comunità microbica, associata al sistema radicale di Vallisneria, e coinvolta nel ciclo dell’azoto. Il lavoro sperimentale è stato svolto in collaborazione della Dott.ssa Elisa Soana (Dottoranda di Ricerca in Ecologia) e del Dott. Marco Bartoli (Università degli Studi di Parma, Dipartimento di Scienze Ambientali). Vallisneria spiralis è un macrofita radicata d’acqua dolce che ha la capacità di crescere in un sistema eutrofico, in condizioni di azoto e nutrienti non limitanti, e nonostante ciò, di trasferire ossigeno a livello radicale, caratteristica che altre macrofite d’acqua dolce ad oggi non hanno mostrato. L’interesse ecologico è indagare il ruolo delle comunità macrofitiche sommerse nella regolazione delle dinamiche biogeochimiche (con particolare riferimento al ciclo dell’azoto) e le relazioni con le comunità microbiche in ecosistemi acquatici caratterizzati da rapida evoluzione in termini di caratteristiche del substrato e disponibilità dei nutrienti inorganici. A tale scopo, lo studio relativo alle comunità microbiche ha inizialmente coinvolto l’isolamento delle specie batteriche, correlate al ciclo biogeochimico dell’azoto, da sezioni di sedimento vegetate da V. spiralis; la preparazione delle colture pure degli isolati batterici e la loro identificazione, attraverso tecniche molecolari. Questo è stato possibile attraverso l’estrazione del DNA genomico da ciascun isolato batterico, l’amplificazione del 16S rDNA, l’analisi dei profili ARDRA seguita dalla selezione dei profili diversamente rappresentati e il sequenziamento del 16S rDNA. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di ottenere dei microrganismi di riferimento, per analisi più dettagliate, come la determinazione dei profili ARISA. In parallelo, è stata svolta una ricerca bibliografica per la selezione dei geni batterici coinvolti nelle reazioni principali del ciclo biogeochimico dell’azoto e la selezione dei primer per la futura messa a punto di una Real Time PCR multiplex. Infine, la tecnica ARISA è stata applicata a sedimenti campionati da zone vegetate e sedimenti prelevati da zone non vegetate, in due momenti importanti per lo sviluppo della macrofita radicata (in fase esponenziale di crescita e alla massima produzione in termini di biomassa) per conoscere ed evidenziare possibili differenze sulla popolazione microbica totale. I risultati ottenuti, sottoposti ad un’approfondita analisi statistica, hanno dimostrato che la presenza di V. spiralis influisce, seppur in modo limitato, sulla diversità microbica, soprattutto in base allo stadio di sviluppo della pianta stessa.M; The role of microorganisms in the biosphere is invaluable. They thrive in all possible niches and play a primary role, contributing to the recycling of the essential elements for life. Microorganisms are also a source of nutrients, being at the root of all ecological food chains and networks. The modern biotechnology science and its applications are based on microbial properties and on the use of microorganisms and their processes for specific and industrial purposes. Even though most of them are beneficial to man, in certain situations they can cause damage to higher living organisms. For all these reasons, the diagnostic microbiology, dealing with identification and detection of microorganisms, plays an increasingly important role. It has long been known that the classical methods are not sufficient for this purpose, in fact, although various isolation and enrichment media have been studied for growing microorganisms involved in different metabolic pathways, only a fraction of these can be cultivated in the laboratory and analysis times are often long and tedious. The purpose of this thesis was to develop molecular techniques for detection of well characterized bacterial species, as well as methods for studying microbial communities in complex environments, assessing the effectiveness and applicability of the methods. Two cases have been studied: • Salmonella enterica and Campylobacter jejuni in chicken meat; • the consistency and diversity of microbial community in the sediment of an eutrophic river system, in the presence, or absence of the rooted macrophyte Vallisneria spiralis. Salmonella enterica and Campylobacter jejuni are microorganisms contaminating the poultry meat, that can cause food-borne infections to humans, which may come into contact by ingestion of contaminated material. EFSA (European Food Safety Authority) has intensified in recent years, studies and publications related to these pathogens, controlling the occurrence of zoonoses and trying to develop systems for the implementation of diagnostic tools to monitor their presence in food. By following these guidelines, in the first phase of the thesis two methods, based on qualitative and quantitative Real Time PCR (qPCR), have been developed and tested to identify and quantify S. enterica and C. jejuni in pure cultures and in chicken samples. Since the target genes are present in single copy in the respective bacteria, it was assumed that each copy of amplicon corresponded to a single chromosome and, consequently, to a single bacterial cell. The first method, previously developed in the Division of Genetics an Environmental Biotechnology of the Department of Environmental Sciences (University of Parma), is based on SYBR®Green, and in this work was tested in a different laboratory from the original, with real-time PCR equipments of brands different from those on which the method was originally developed. The reproducibility of the data obtained with the different equipments was evaluated by calculating the relative standard deviation (RSDR), as indicated by the Codex Alimentarius and by the variance analysis. The method for the quantification of Salmonella in artificially contaminated chicken samples with this organism, has proved transferable from one equipment to another, even if different operators have worked. For Campylobacter, the method should be further improved, since only one of the samples analyzed gave reproducible results on the two equipments used. However, the same method, tested at one of the leading companies in the poultry food chain, has proved to be suitable for the qualitative detection of Campylobacter. A system for the detection and quantification of S. enterica and C. jejuni has also been developed using TaqMan ® probes, which, not only have higher specificity than the SYBR®Green but allows to quantify simultaneously two target DNA in the same reaction. The results of the analysis conducted on pure cultures of microorganisms and samples of chicken contaminated with them, showed a good consistence between single-and double-qPCR and conventional microbiological methods, for most of the samples analyzed. Very interesting result is the ability to simultaneously detect, 10 copies of genomic DNA of S. enterica and C. jejuni, equal to 103 CFU / ml. Results of a preliminary study on consistency and diversity of microbial community in the sediment of an eutrophic river system, in the presence, or absence of the rooted macrophyta Vallisneria spiralis are shown in the second part of this dissertation. Aim of this work was to develop analysis tools to be used for understanding the role, on nitrogen recycling, of the microbial community, associated to the root system of Vallisneria. The experimental work was done in collaboration with Dr. Elisa Soana (PhD student in Ecology) and Dr. Marco Bartoli (University of Parma, Department of Environmental Sciences). Vallisneria spiralis is a rooted freshwater macrophyte with the ability to grow in a eutrophic system, and yet under not limiting conditions of nitrogen and nutrients, to transfer oxygen to the root level, a feature, so far, never shown by other freshwater macrophytes. The ecological interest of this investigation is to understand the role of submerged macrophytic communities in the regulation of biogeochemical dynamics (with particular reference to the nitrogen cycle) and relations with the microbial communities in aquatic ecosystems characterized by rapid evolution in terms of substrate characteristics and availability of inorganic nutrients. To this end, the study of microbial communities has initially involved the isolation of bacterial species, partecipating to nitrogen cycle, from the sediment vegetated by V.spiralis; the preparation of pure cultures of the isolated bacteria and their identification, by molecular techniques. This was possible by genomic DNA extraction from each bacterial isolate, amplification of 16S rDNA, analysis of ARDRA profiles, followed by selection of uniquely represented patterns and sequencing of their 16S rDNA. The aim of this work was to obtain reference microorganisms for more detailed analysis, such as ARISA profiles. In parallel, a bibliographic search was performed in order to select bacterial genes involved in the major reactions of biogeochemical cycle of nitrogen and select primers for the future development of a multiplex real-time PCR. Finally, the ARISA technique was applied to sediments sampled either from vegetated, and not vegetated areas, collected in two important steps during the development of the macrophyte (in exponential phase of growth and maximum production in terms of biomass)with the aim of highlighting possible differences on the total microbial population. The results obtained, and subjected to accurate statistical analysis, evidentiated that the presence of V. spiralis affects, albeit in a limited way, the microbial diversity, in particular according to the stage of plant development. Sun, 25 Mar 2012 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1978 2012-03-25T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1839 Title: FUNCTIONAL ANALYSIS OF POPLAR (Populus nigra L. and P. nigra x P. deltoids) DURING ENVIRONMENTAL EXPOSURE TO METALS Authors: Imperiale, Davide Abstract: Dispersal of trace elements, metals and organics is relevant for environmental contamination and for fresh water utilization. Plant species have been used to decrease or remove the contaminants in polluted sites and in particular, tolerant and hyperaccumulator species seem promising for removal of metals in contaminated soils. The practical application of natural hyperaccumulators in phytoremediation is difficult because of their small biomass at maturity and reduced growth rates. For these reasons the metal uptake capacity of plants with higher biomass, such as trees belonging to Salicaceae family like poplar and willow, has been investigated. Laboratory and field trials have found that different clones of the genus Populus have different tolerance and metal uptake in contaminated environments. In this work we studied the behavior of three Italian selected poplar clones: P.nigra (clones 58-861 and Poli) and a hybrid P.nigra x deltoides (A4A), which showed different Cd tolerance and capacity and Cd uptake, accumulation and traslocation. The modifications occurring in the proteome of the three clones subjected to Cd treatments were investigated by comparing also the physiological behaviour of the clones. Rooted cuttings of three poplar clones were grown in hydroponic cultures with 0 μM CdSO4 (control), 20 μM CdSO4 for 48 hours (short term treatment) and 20 μM CdSO4 for 14 days (long term treatment). (i) Different physiological parameters were analyzed: total leaf area, stem growth and elongation of the roots. Metal uptake and root to shoot translocation were observed by mineral analysis by Atomic Absorption Spectroscopy (ASS). Metal compartmentalization in leaves, roots and stems were analyzed by Scanning Electron Microscopy with microanalysis (SEM/EDX). (ii) Proteomic analysis was performed on crude protein extracts, obtained from leaves. Proteins with different isoelectric point (pI) and hydrophobicity were separated by a 2D liquid chromatography technique (ProteomeLab PF2D, Beckman). Qualitative and quantitative differences between protein profiles of treated and untreated samples were evidenced by DeltaVue Software (Eprogen). Proteins differently abundant in various conditions were characterized by MALDI-TOF/MS to infer their possible role in metal response. The results will be discussed with the aim to understand the different processes at the basis of accumulation and tolerance of metal by plant species.; Il lavoro di ricerca ha avuto come oggetto una serie di analisi mirate a migliorare la comprensione dei meccanismi di tolleranza e accumulo di metalli pesanti in diversi cloni di pioppo. Tre cloni del genere Populus sono stati studiati in relazione alla loro risposta alla contaminazione da metallo pesante quale il cadmio, al fine di comprendere e quantificare le differenze che esistono tra di loro in termini di resistenza, capacità di accumulo e traslocazione del metallo, e al fine di comprendere le basi molecolari delle diverse risposte. Talee di Pioppo (Populus sp.) ottenute da due linee pure (cloni Poli e 58861) e da una linea ibrida (A4A), sono state fatte crescere in coltura idroponica e trattate con 20µM CdSO4 per 48 ore (short term) o per 14 giorni (long term). L’effetto fisiologico del trattamento con il metallo è stato valutato statisticamente misurando una serie di parametri morfologici e fisiologici (numero foglie, larghezza, lunghezza e area fogliare, lunghezza totale degli steli e lunghezza della radice principale, percentuale delle zone interessate da clorosi, necrosi e lesioni fogliari). L’ analisi del contenuto di Cd, mediante assorbimento atomico, nei diversi tessuti degli organismi in analisi ha permesso di valutare le differenze tra il cloni in termini di capacità di accumulo e traslocazione del metallo. Inoltre, per identificare biomarcatori di accumulo e traslocazione sono state effettuate analisi di proteomica comparativa mediante un sistema “gel free” di cromatografia liquida bidimensionale ProteomeLab Pf2D. L’identificazione di alcune di queste proteine mediante spettrometria di massa MALDI-TOF ha potuto definire quali classi funzionali sono coinvolte nei meccanismi di risposta agli stress da metalli e quali possano essere le basi molecolari che spiegano l’estrema variabilità intraspecifica in risposta alla contaminazione da cadmio. Infine la mappatura e la distribuzione del cadmio (Cd) e di altri elementi, come il calcio (Ca) e il potassio (K), nei diversi tessuti delle piante è stata possibile grazie alla microanalisi con SEM/EDX. Sun, 25 Mar 2012 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1839 2012-03-25T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1837 Title: Unraveling Mitochondrial Biogenesis in Saccharomyces cerevisiae: Genomics, Genetics and Biochemical Approaches Authors: Tigano, Marco Abstract: I mitocondri, oltre al classico ruolo di centrali energetiche delle cellule, sono organelli di vitale importanza in molti altri processi come invecchiamento e apoptosi. Esiste un esteso scambio di informazioni tra genoma nucleare e mitocondriale che permette di integrare il metabolismo mitocondriale nel network cellulare. Tutti i processi che concorrono nello stabilire una corretta funzionalità mitocondriale e una sua corretta integrazione sono collettivamente noti come “biogenesi mitocondriale”. Il lievito S. cerevisiae è stato uno degli organismi modello più estensivamente utilizzati nella ricerca in campo mitocondriale e molti approcci sono stati utilizzati per identificare geni nucleari coinvolti nel metabolismo mitocondriale. Negli ultimi anni analisi high throghput sono diventate molto comuni ma nonostante la grande quantità di informazioni raccolte il proteoma mitocondriale è ancora lontano dall’essere completato. Abbiamo eseguito uno screening genomico incentrato sull’identificazione di geni nucleari coinvolti nella biogenesi mitocondriale. Tenendo presente che alcuni mutanti mitocondriali esprimono un fenotipo evidente solo in condizioni di stress e ipotizzando che le numerose analisi riportate in letteratura, condotte sempre alla temperatura ottimale di 30ºC, potessero aver sottostimato il numero di geni coinvolti, abbiamo eseguito le analisi alla temperatura di 37ºC. Utilizzando un terreno ricco in presenza di etanolo come fonte di carbonio e analizzando la crescita a 30 e 37ºC abbiamo identificato 488 geni la cui delezione comporta un difetto ossidativo. Attraverso un processo di filtraggio dei dati e conferme sperimentali abbiamo selezionato 177 geni mai correlati alla funzionalità mitocondriale o la cui funzione fosse ancora parzialmente o totalmente sconosciuta. Per la maggior parte di questi il fenotipo osservato era specifico a 37ºC. Abbiamo inoltre dato una prima caratterizzazione del difetto OXPHOS analizzando lo stato dei citocromi respiratori e il consumo di ossigeno, raggruppando i candidati in quattro classi fenotipiche che descrivessero la severità dei fenotipi osservati. Differenti fattori di trascrizione, modificatori istonici e pathway cellulari si sono rivelati arricchiti nel nostro dataset a 37ºC. Modificazione dei tRNA citoplasmatici, acetilazione N-terminale e pathway di risposta al pH alcalino sono tra gli identificati. Una importanza funzionale di questi processi nella biogenesi mitocondriale in condizioni di stress è stata quindi provata per la prima volta. Uno dei pathway più interessanti è quello riguardante la modificazione di tRNA citoplasmatici nella posizione wobble dell’anticodone, arricchito a 37ºC. Per questo processo non era mai stata mostrata una connessione con la biogenesi mitocondriale. Abbiamo quindi esplorato la possibilità che tRNA modificati da questo pathway potessero essere essenziali per la sintesi proteica mitocondriale a 37ºC. Studiando tre particolari mutanti in geni rappresentativi delle tre reazioni fondamentali di modificazione siamo stati in grado di dimostrare chiaramente che la sintesi proteica mitocondriale è regolata da questo pathway. Il meccanismo molecolare sottostante rimane però ancora sconosciuto. Infine è stato caratterizzato funzionalmente un singolo gene la cui delezione è causa di difetti OXPHOS a 37ºC. Codifica per una proteina mitocondriale a funzione sconosciuta partner ipotetico della ossidoreduttasi Arh1. Il mutante nullo nel gene YIR024C è stato sottoposto ad una estensiva caratterizzazione biochimica che ne ha messo in luce differenti difetti nella catena respiratoria mitocondriale. Le subunità del complesso IV codificate nel genoma mitocondriale (Cox1, Cox2 e Cox3) e il Cytb si sono rivelati fortemente abbattuti a 37ºC come le attività enzimatiche dei rispettivi complessi. Inoltre nelle stesse condizioni anche il profilo del heme mitocondriale mostrava difetti. Abbiamo costruito un ceppo in grado di esprimere una versione della proteina recante al suo C terminale un tag di riconoscimento. In questo modo ne abbiamo determinato la localizzazione mitocondriale, la topologia e il peso nativo. Queste analisi hanno confermato che Yir024c è una proteina mitocondriale di membrana interna, che espone nello spazio intermembrana un dominio globulare di 152 aminoacidi. Il peso nativo si è rivelato essere circa 250Kda, indicativo di appartenenza ad un complesso proteico. L’ipotetico partner fisico Arh1 però non è stato identificato nello stesso complesso e inoltre non è stata osservata alcuna co-precipitazione in studi di affinità. Questo ci ha permesso di concludere che i due prodotti proteici non interagiscono fisicamente. Per identificare i partner funzionali di Yir024c il complesso di 250Kda è stato purificato e sottoposto ad analisi di spettrometria di massa, ancora in corso di svolgimento.; Mitochondria, besides their well-known role of “powerhouses” of the cell, is a central organelle in many others cellular processes as aging and apoptosis. An extensive interplay occurs between nuclear and mitochondrial genome, and allows cells to integrate mitochondrial metabolism in the cellular network. All the processes that concur to proper mitochondrial functionality and integration are collectively known as “mitochondrial biogenesis”. The yeast S. cerevisiae has been one of the most used model organism for mitochondrial research and many approaches have been used to identify nuclear genes involved in mitochondrial metabolism and in the last few years genome-scale approaches became very popular. However, the yeast mitochondrial proteome is still not totally covered. We performed a genome-wide screening focused on identification of nuclear genes involved in mitochondrial biogenesis. Knowing that certain genes express mitochondrial phenotypes only in stressful conditions we carried out the analysis at 37˚C postulating that previous published results, obtained in experiments at 30˚C, could have underestimated the number of nuclear genes involved in such processes. Using complete ethanol media and analysing growth at 37˚C and 30˚C we identified 488 genes whose deletion led to a defect. Through data mining and experimental confirmation we generated a list of 177 nuclear genes that were previously not linked to mitochondrial biogenesis or with a mitochondrial role still poorly understood. For the majority of those the mitochondrial phenotype was expressed only at 37˚C. Furthermore we gave a first characterization of the OXPHOS defect analysing cytochromes content and oxygen consumption, creating 4 phenotypical classes to depict the different impairments observed. Interestingly several histone modifiers, transcriptional factor and cellular pathways were specifically enriched in our dataset at 37˚. Cytoplasmic tRNAs chemical modification, N-terminal protein acetylation and alkaline pH sensing were among the pathways identified. A functional importance of such processes in mitochondrial biogenesis under stress is for the first time discussed. A particular attention has been given to one of the pathways identified in the described screening. Indeed enrichment in the pathway of chemical modification in wobble bases of cytoplasmic tRNAs was very interesting since a relation between this process and mitochondrial biogenesis was never shown. We explored the possibility that tRNAs modified in this pathway could be essential for mitochondrial protein synthesis at 37˚C studying in particular the effects of three deletions in genes representative of the three different steps of the pathway. We were able to demonstrate clearly that under stress the mitochondrial protein synthesis is regulated by cytoplasmic tRNAs chemical modification, although the molecular mechanisms underlying are still uncertain. Finally we functionally characterized YIR024C, identified in the aforementioned screening as gene whose deletion caused OXPHOS defects at 37˚C. It codes for a mitochondrial protein of unknown function, a hypothetical interactor of Adrenodoxin Reductase (Arh1p). Through extensive biochemical characterization a yir024c null mutant was found to have several mitochondrial respiratory chain defects. Mitochondrial encoded subunits of complex IV (Cox1p, Cox2p and Cox3p) and Cyt b were markedly decreased at 37˚C, along with corresponding enzymatic activities. Also mitochondrial heme profile showed impairments in the same conditions. We obtained a strain expressing an epitope-tagged version of the protein, used to determine the mitochondrial localization, topology and the native size. These analyses confirmed that Yir024c is a mitochondrial protein, integral to the inner membrane and exposing a globular domain of 152 amino acids in the inter membrane space. The protein revealed a native size of about 250Kda, indicating that it resides in a complex. We failed in confirming the predicted physical interaction with Arh1p as this protein was not part of the same complex of Yir024cp and was not found to co-precipitate in affinity purification studies. To identify Yir024cp functional partners the 250Kda complex was purified and mass spectrometry analyses are in progress. Wed, 29 Feb 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1837 2012-02-29T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1836 Title: SDH assembly in S. cerevisiae: focus on the functional role of SDH6 Authors: Meloni, Francesca Abstract: La succinato deidrogenasi (SDH) o complesso II è un enzima chiave del ciclo di Krebs e della catena respiratoria mitocondriale. E’ una ferro zolfo flavo proteina che catalizza l’ossidazione del succinato a fumarato con relativo passaggio degli elettroni dal FADH2 attraverso i tre centri Fe-S e infine all’ubichinone che viene ridotto ad ubichinolo. L’enzima, ubiquitario in tutte le specie, è un eterotetramero, di 124 kDa, composto da quattro sub-unità che sono codificate da altrettanti geni nucleari, SDHA-D nei mammiferi (corrispondenti ai geni SDH1-4 in lievito). E’ noto che difetti nelle diverse subunità dell’enzima sono associate a patologie differenti in relazione a quale gene è mutato. Infatti mentre mutazioni germinali in SDHA sono associate ad una patologia neurodegenerativa, la Sindrome di Leigh, mutazioni a carico di SDHB, SDHC, SDHD predispongono alla formazione di forme tumorali quali paragangliomi o feocromocitomi. Sebbene la struttura e la funzione del complesso SDH siano note da anni, poco si sa circa il suo assemblaggio. Solo recentemente sono stati descritti due nuovi fattori, SDHAF1(SDH6 in lievito) e SDHAF2 (SDH5) che hanno un ruolo evolutivamente conservato e dedicato nell’assemblaggio del complesso II. Anche mutazioni a carico dei geni che codificano per questi due fattori di assemblaggio sono associate a patologie diverse: disturbi mitocondriali e cancro. Il primo assemblatore specifico per la succinato deidrogenasi, Sdh6p, Sdhaf1p nell’uomo, è stato scoperto in seguito ad uno studio, compiuto presso l’Istituto Neurologico C.Besta dal gruppo di ricerca del Dott. M. Zeviani, su bambini affetti da leucoencefalopatia progressiva, associata ad una significativa diminuzione sia di attività enzimatica SDH che dei livelli di enzima SDH, supportato da studi eseguiti in lievito (Ghezzi et al., 2009). L’analisi di sequenza ha individuato due mutazioni missenso R55P e G57R in una regione, chiamata LOC644096, che codifica per un putativo prodotto genico di 115 aminoacidi a funzione sconosciuta. Allo scopo di valutare se le mutazioni missenso che cosegregavano con la patologia fossero effettivamente responsabili della diminuita attività del complesso II, è stato utilizzato il lievito come sistema modello. Numerosi studi hanno infatti dimostrato che questo organismo è un ottimo modello sia per studiare gli effetti primari delle mutazioni patogene che per determinare i meccanismi molecolari che inducono patologie mitocondriali. Il lievito presentava un putativo ortologo del gene umano, anche esso a funzione sconosciuta che codifica per una piccola proteina di 79 aa: YDR379c-a. L’allineamento delle due sequenze ha evidenziato come l’identità condivisa tra le due sequenze fosse del 21% e come i residui coinvolti nelle due mutazioni, R55P e G57R fossero conservati. Gli studi funzionali condotti nel lievito e in linee cellulari umane hanno indicato che la proteina identificata sia richiesta per l’assemblaggio e il corretto funzionamento del complesso II, dal momento che la sua mancanza determina una drastica riduzione della attività succinato deidrogena sica. Quale sia però il ruolo biochimico di Sdh6 nel processo di assemblaggio della SDH non è ancora stato chiarito. Obiettivo del seguente lavoro di ricerca è stato quello di contribuire alla comprensione della funzione di questo fattore utilizzando approcci genetici e biochimici. Sdh6p è caratterizzata dalla presenza di un motivo LYR che ci ha spinto ad indagare il ruolo di questa proteina nell’inserimento dei centri Fe-S nel backbone del complesso II. Questi motivi proteici difatti sono una signature per proteine coinvolte nel metabolismo dei clusters Fe-S. Sdhp6 inoltre, presenta una significativa similarità di sequenza con Isd11p, proteina nota essere necessaria per la biogenesi dei clusters Fe-S. Sulla base di tali considerazioni si è deciso di valutare se ISD11 in multi copia potesse ripristinare il fenotipo OXPHOS del mutante sdh6 e viceversa. I risultati indicano che la somiglianza strutturale tra i due geni non è accompagnata da una qualche omologia funzionale. E’ stato poi analizzato se SDH5 e TCM62, codificanti gli altri due fattori di assemblaggio del complesso II, espressi in multi copia ripristinassero la crescita ossidativa del mutante sdh6 e viceversa. In nessun caso si è ottenuto il rescue del fenotipo di crescita. In seguito sono state overespresse nel mutante nullo le quattro subunità SDH per valutare se questo potesse incrementare l’attività SDH. A differenza di quanto osservato nel ceppo parentale in cui l’attività SDH aumentava del 50% nel ceppo Δsdh6 che overesprime l’intero complesso non è stato osservato alcun incremento dell’attività SDH. Questo dato ha suggerito come Sdh6p sia un rate limiting factor nel processo di assemblaggio del complesso II. Risultati relativi alla determinazione del valore di Km per il succinato, uguale tra mutante e wild-type, hanno suggerito come l’abbattimento specifico dell’attività SDH nel mutante sdh6 sia dovuto ad un ridotto numero di unità enzimatiche piuttosto che ad un’alterazione qualitativa del complesso. Per aver ulteriore conferma di ciò sono stati dapprima valutati in SDS-PAGE i livelli di Sdh1p e Sdh2p nel ceppo Δsdh6. In secondo luogo è stato valutato lo stato di assemblaggio del complesso in condizioni native attraverso una BN-PAGE. I risultati ottenuti hanno consentito di affermare che la ridotta attività SDH misurata nel mutante è imputabile ad una riduzione del complesso SDH correttamente assemblato. Per valutare se Sdh6p contattasse il complesso o intermedi di questo o altri complessi molecolari sono state costruite delle varianti di Sdh6p taggate sia con l’epitopo HA che con la coda di istidine. I risultati ottenuti suggeriscono che Sdh6p non è associato né al complesso SDH né ad alcun complesso molecolare in quanto migra in forma monomerica. Utilizzando Sdh6 His-tag, sfruttando le interazioni tra Ni-NTA e i residui di 6HIS inseriti nella proteina, è stato dimostrato che Sdh6p non interagisce né con la subunità Sdh1 né con Sdh2. Parallelamente per cercare di ottenere maggiori informazioni circa il ruolo funzionale di SDH6 è stata intrapresa una ricerca di soppressori multi copia nel mutante nullo Δsdh6. Questo screening ha portato all’identificazione di due geni, YAP1 e YAP2 codificanti due fattori di trascrizione coinvolti in diversi processi cellulari. Tuttavia il rescue del difetto OXPHOS non era accompagnato da un ripristino dell’attività SDH. Questo risultato ha suggerito che Sdh6p svolgesse un altro ruolo nella cellula. Peraltro l’osservazione che diversi mutanti sdh, aventi la stessa attività residua SDH crescessero meglio su fonti di carbonio ossidabili rispetto al mutante sdh6, rafforzava l’ipotesi relativa ad un duplice ruolo di Sdh6p. Per capire in quale modo potesse agire il meccanismo di soppressione esercitato da Yap1p e Yap2p e quindi avere qualche indicazione circa l’altro ruolo di Sdh6 sono state eseguite alcune sperimentazioni sulla base di due funzioni svolte da Yap1 eYap2: risposta allo stress ossidativo e metabolismo del ferro. L’insieme dei risultati ottenuti favoriscono l’ipotesi che il meccanismo di soppressione esercitato da YAP1 e YAP2 sia da attribuire al loro ruolo legato al metabolismo/omeostasi del ferro. Infatti l’aggiunta di ferro al terreno di crescita consente il rescue del fenotipo OXPHOS nel mutante Δsdh6 non accompagnato da un incremento dell’attività SDH. Pertanto i risultati ottenuti suggeriscono che il secondo ruolo di Sdh6p possa essere correlato al metabolismo del ferro.; Yeast is a well recognised model for the study of human mitochondrial pathologies thanks its exceptionally ability to survive without a functional mitochondrial respiratory metabolism, provided that a fermentable carbon source is made available. Succinate dehydrogenase (SDH, complex II) is a conserved mitochondrial enzyme of the inner membrane that catalyzes the oxidation of succinate to fumarate during TCA cycle, using at the same time the reducing equivalents in the electron transport chain (ETC). Despite the extensive knowledge of the structural and catalytic properties of the complex, only two assembly factors specific for the SDH complex has been recently found: SDHAF1 and SDHAF2. The SDHAF1 gene was identified in humans as linked to infantile leukoencephalopathy. A yeast strain deleted in SDH6, the SDHAF1 ortholog, was OXPHOS incompetent, due to a severe and specific reduction of SDH activity. However, the Km value for succinate was similar in wild-type and in the null mutant, suggesting that defective SDH activity was caused by reduced number of enzyme units rather than by qualitative alterations of complex II. We have given more insights into the knowledge of SDH6 through genetic and biochemical studies performed in S. cerevisiae. Affinity purification analyses have shown that Sdh6p is not a physical interactor of subunit 1 and 2 of SDH complex. Furthermore Sdh6p is not part of complex II or other molecular complexes, as shown in BN-PAGE analyses. Moreover, Sdh6p is a rate limiting factor of SDH assembly: indeed despite the overexpression of all four SDH subunits in the null mutant the SDH activity is not restored unlike what occurred in the wild type strain suggesting the pivotal role of this protein in the complex II assembly. The results obtained in this work suggested that SDH6 plays a different role from that played by SDH5, the yeast ortholog of SDHAF2. Indeed the overexpression of SDH6 did not rescue the OXPHOS defect of Δsdh5 and viceversa. Therefore the two SDH specific assembly factors are not interchangeable. The presence of a LYR motif in the Sdh6 protein prompted us to investigate a putative role in the insertion of Fe-S clusters in complex II. Isd11p, a protein involved in the iron-sulfur biogenesis, shares a significant sequence similarity with Sdh6p and contains a LYR motif. We tried to rescue the OXPHOS deficient phenotype of sdh6 mutant by overexpressing ISD11 but the results obtained indicated that the two proteins do not share similar functions. To further investigate the functional role of SDH6 a search for multicopy suppressors was performed. This analysis identified YAP1 and YAP2, two transcription factors involved in several cellular processes. Although YAP1 and YAP2 are able to rescue the OXPHOS defect of sdh6 mutant, their action is not exerted by increasing the SDH activity. Their suppression mechanism seems to be independent of complex II. Thus Sdh6p might have an additional role besides the SDH assembly: if this is the case the OXPHOS negative phenotype of sdh6 null mutant would be due to both a reduced SDH activity and to a lack of some other putative function. The observation that several sdh mutants with a 30-40% of residual SDH activity are able to grow on oxidative carbon sources much better than Δsdh6 strengthens this hypothesis. In order to understand the mechanism of suppression exerted by YAP1 and YAP2 we focused on two main functions linked to these genes: the oxidative stress and the iron metabolism. All together these analyses favor the hypothesis that YAP1/YAP2 suppression mechanism could be mainly ascribed to their role in iron metabolism/homeostasis. Moreover when the effects of iron supplementation on the oxidative growth of the Δsdh6 strain were tested a rescue of the OXPHOS phenotype was observed without any increase of SDH activity. The results obtained support the view that the second role of Sdh6p could be related to iron metabolism/homeostasis. Wed, 29 Feb 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1836 2012-02-29T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1833 Title: Fattori ecologici nel processo riproduttivo di una specie marina nidificante, Symphodus ocellatus: ruolo dell’habitat e delle risorse Authors: Timpanaro, Angela Abstract: Nella complessa strategia riproduttiva delle specie marine nidificanti intervengono diverse componenti ecologiche abiotiche (i.e. caratteristiche fisiche del substrato) e biotiche (i.e. disponibilità di specie algali) che potrebbero assumere un ruolo importante nel successo riproduttivo. La formulazione e l’analisi di diverse ipotesi sul ruolo di queste componenti costituisce lo scopo del presente lavoro di ricerca usando come modello il labride Symphodus ocellatus. Il primo passo è stato quello di indagare circa la distribuzione spaziale della popolazione all’interno dell’area di studio, sia durante il periodo riproduttivo sia durante i periodi non riproduttivi. L’indagine è stata svolta su diversi ambienti: roccia, sabbia e Posidonia oceanica. I risultati hanno mostrato che la specie predilige i fondali rocciosi, dove trascorre l’intera fase adulta, e solo occasionalmente si trova anche su P. oceanica che potrebbe utilizzare come rifugio temporaneo in presenza di predatori. Inoltre, esaminando diverse località a substrato roccioso, è emerso che gli individui di S. ocellatus erano presenti solo in alcune di queste. Questo potrebbe indicare la presenza di fattori capaci di influire fortemente sulla distribuzione spaziale della popolazione. Il secondo obiettivo è stato quello di indagare sul ruolo dell’habitat nella riproduzione di S. ocellatus, ad una scala spaziale più piccola. Nello specifico sono stati studiati per la prima volta i requisiti di habitat per la nidificazione secondo la domanda: Ad una scala spaziale minore, a livello di microarea, esistono delle variabili che potrebbero influenzare la scelta del sito di nidificazione? I risultati sembrano indicare che S. ocellatus per la costruzione del nido predilige bassi fondali con una ricca copertura vegetale. In particolare, la presenza di Dictyotales e di forme algali a canopy alta sono requisiti elettivi fra le variabili esaminate per la scelta del sito di nidificazione. Le alghe a canopy alta potrebbero costituire una forma di protezione del nido, rappresentando una barriera fisica per l’attenuazione del moto ondoso, specie in ambienti tanto turbolenti come quelli di basso fondale. Un altro aspetto che potrebbe essere legato alla preferenza di ambienti a canopy alta potrebbe essere il rischio predatorio. In questo senso le alghe erette potrebbero determinare una diminuzione della visibilità del nido che risulterebbe vantaggiosa contro le incursioni di maschi cospecifici e di predatori. Nel terzo obiettivo la scala di indagine si è ridotta ulteriormente a livello di “nido”. È stato approfondito il ruolo delle risorse usate dal labride per la costruzione del nido studiandone la struttura e la composizione algale. In questa fase di indagine è stata avanzata anche l’ipotesi che le specie algali impiegate nella costruzione del nido siano scelte dal labride attivamente. Studiando la struttura del nido sono emerse delle differenze fra la porzione superiore e la porzione inferiore in termini di composizione algale, specie algali differenti sono incorporate in siti differenti all’interno del nido. In particolare, J. rubens caratterizza la porzione superiore del nido che costituisce il substrato di deposizione delle uova, mentre Cystoseira spp. e Dictyota linearis caratterizzano la composizione in specie della porzione inferiore, altamente intrecciate costituiscono la base del nido. L’esame del nido suggerisce, quindi, che il pesce costruisce il nido dalla base verso la parte superiore cambiando gradualmente le specie algali impiegate. Per quanto riguarda la composizione in specie del nido è risultato che le specie più utilizzate per la costruzione sono rispettivamente Jania rubens, Dictyota linearis, Lophocladia lallemandii e Cladophora rupestris. Queste specie infatti rappresentavano da sole più del 80% del peso secco dei nidi osservati. Inoltre, i risultati hanno confermato l’ipotesi secondo la quale le specie algali impiegate nella costruzione del nido sono scelte attivamente dal labride. Infatti S. ocellatus seleziona attivamente determinate specie algali rispetto ad altre. Nello specifico è risultato un alto valore di preferenza per la specie Jania rubens la cui presenza nell’habitat intorno al nido risultava essere inferiore rispetto ad altre specie algali (per esempio Cystoseira spp. e Dictyota linearis). La selezione attiva da parte di S. ocellatus per questa specie potrebbe essere dovuta alle caratteristiche strutturali dell’alga. Tali caratteristiche potrebbero rispondere a determinate esigenze funzionali implicate nella protezione e nel corretto sviluppo delle uova, e quindi nel successo riproduttivo. Infatti la fitta matrice di frammenti dell’alga calcarea, flessibili ed al tempo stesso molto resistenti, potrebbe conferire al nido una resistenza meccanica, protezione delle uova e allo stesso tempo un’adeguata ossigenazione, superiori a quelli forniti da altre specie algali. L’ultimo obiettivo del dottorato è stato quello, quindi, di approfondire il ruolo funzionale delle specie algali presenti nel nido per rispondere alla domanda: Perché il labride impiega determinate specie algali nella costruzione del nido rispetto ad altre? È stata così formulata un’ipotesi basata sul comportamento meccanico delle specie: le specie algali più rappresentate all’interno del nido di S. ocellatus hanno delle performance meccaniche migliori in termini di resistenza rispetto alle specie meno presenti. I risultati delle prove di micropressione, microtrazione e delle prove a rottura confermano tale ipotesi e mostrano come le specie più selezionate da parte del pesce sono le più resistenti. Nel dettaglio, Jania rubens, Dictyota linearis e Cladophora rupestris che sono le specie più usate presentano un carico di rottura maggiore rispetto alle specie Laurencia hybrida e Cystoseira sp. meno selezionate dal Tordo ocellato. Questo studio rappresenta un primo passo verso la comprensione dei processi che sono alla base delle scelte effettuate da S. ocellatus relative l’uso delle risorse impiegate nel delicato processo della nidificazione. Wed, 14 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1833 2011-12-14T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1832 Title: Population dynamics and resilience of green abalone Haliotis fulgens in Isla Natividad Authors: Rossetto, Marisa Abstract: Aim of my thesis project was to evaluate the efficacy of two marine reserves in Isla Natividad (Mexico) as a management tool for the green abalone (Haliotis fulgens) fishery. The first step was to develop and calibrate a demographic for green abalone to describe its dynamic when subjected to exploitation. To do so, I defined a size-based matrix model that allows incorporating information on growth, size-specific survival and size-specific fecundities; specifically, I conducted an extensive literary review to estimate the corresponding vital rates. I also used fishery data collected by fishermen on Isla Natividad to calibrate the model, i.e.to estimate density-dependence in the larval stage and size-dependent fishing mortality. In particular, through this model, I: - examined recent trends in abalone abundance in Isla Natividad and compared the current status of the stock with theoretical carrying capacity; - computed informative fishery reference points such as maximum sustainable yield (MSY) and effort that guarantees the MSY to compare them with current and historical fishery yields and exploitation rates; -assessed the recovery potential of abalone populations and investigate the likely trend of abundances and yields under different exploitation scenarios. Then, I investigated if the reserves can increase, or at least maintain, the catch of abalones in the fishable areas through larval spillover, that is, a net export of larvae during the planktonic stage from the protected toward the unprotected zones. The expected increase in abalone abundance inside the marine reserves and the increase in mean size of sexual mature individuals, in fact, could positively influence the reproductive output of the population with an enhanced production of eggs, which, through larval dispersal, can contribute to the recruitment also in the areas outside the reserve. To explore the likely trends in abundance and catches of these commercially important species both in the short and in the long term, I extended the above-mentioned model formulation by defining a spatially-explicit version of the model. I assumed that the populations were distributed along a linear array of contiguous patches, representing the fishable and the protected blocks along the perimeter of the island. As abalones are sedentary species, I assumed that the connectivity between subpopulations was driven by the exchange of larvae in the planktonic phase. Dispersal kernels for larval movement were defined to describe movement probability between more or less distant patches. In particular, I: - examined the likely trends in abalone abundance and fishery yields catches under different assumptions of reserve establishment (intended as percentage of fishing grounds protected and size of individual no-take areas); - assessed if larval spillover effect can compensate for the decrease in abalone catches due to the reduction of the fishing grounds, and, if yes, after how much time are the benefits likely to occur; -analyzed if the results in terms of population trends and fishery benefits are sensitive to the spatial arrangement of the reserve. Wed, 29 Feb 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1832 2012-02-29T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1831 Title: Riciclo dell’azoto nitrico ed emissione di gas serra nei fontanili Authors: Laini, Alex Abstract: Nel bacino del fiume Po le attività agricole hanno determinato flussi verticali di macro e micro-inquinanti, diretti dai campi verso le falde acquifere, in particolare di nitrato e di erbicidi. L'eccesso di ione nitrato nelle falde porta a problemi per la potabilità delle acque e, una volta che queste acque raggiungono la superficie, ad una potenziale eutrofizzazione dei reticoli idrografici principale e secondario. I processi che portano alla formazione e alla degradazione del nitrato nelle acque sotterranee producono metaboliti tra i quali l'N2O, gas con un elevato potenziale serra ed in grado di distruggere l'ozono stratosferico. In questo lavoro di tesi sono stati indagati i pattern di formazione e di dispersione di nitrato, protossido di azoto e di erbicidi nei fontanili, particolari ecosistemi dipendenti dalle acque sotterranee localizzati nella fascia di media pianura del nord Italia. Gli obiettivi secondari della tesi sono stati quelli di valutare il riciclo di nitrato verso il reticolo idrografico superficiale, di quantificare le emissioni di N2O dai fontanili, di inferire i processi che legano il nitrato all'N2O, di evidenziare trend temporali e spaziali delle caratteristiche chimico-fisiche delle acque dei fontanili e di tracciare il destino degli erbicidi dal campo coltivato verso il fontanile. Un numero di fontanili variabile, localizzati prevalentemente nell'area di media pianura compresa tra Adda e Mincio, è stato analizzato al fine determinare le caratteristiche chimico-fisiche dell'acquifero superficiale in corrispondenza della fuoriuscita dell'acqua dai tubi di drenaggio dei fontanili. Attraverso diversi metodi sono state determinate le concentrazioni delle forme inorganiche dell'azoto (NH4+, NO2-, NO3-), dei gas disciolti (N2O, CO2, CH4) e dei principali erbicidi utilizzati nell'area di studio. I risultati indicano un accumulo nell'acquifero superficiale di NO3-, con concentrazioni maggiori di 50 mg l-1, e di N2O, con concentrazioni di due ordini di grandezza maggiori rispetto all'equilibrio acqua-atmosfera. Non sono state evidenziate forti variazioni temporali nelle concentrazioni di questi due inquinanti, a significare carichi costanti durante tutto l'anno verso il reticolo idrografico superficiale e l'atmosfera. L'unico erbicida rinvenuto nelle acque dei fontanili è stato la terbutilazina (TBA) e il suo prodotto di degradazione desetil-terbutilazina, utilizzati per il diserbo del mais, coltura prevalente nell'area di studio. Analisi dei tempi di emivita della TBA indicano una distanza dalla fonte di inquinamento minore di 5 km e quindi un inquinamento circoscritto nello spazio. Questo lavoro di tesi ha permesso di mettere in evidenza l'importanza dell'acquifero superficiale come sink e source di macro e micro-inquinanti di origine agricola. In un contesto di miglioramento qualitativo delle acque superficiali, politiche volte ad un'ottimizzazione delle pratiche agricole potrebbero risultare inefficaci sul breve termine. Da qui la necessità di studi multidisciplinari per risolvere un problema molto complesso, quale quello dei movimenti degli inquinanti nelle acque di falda. Sat, 31 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1831 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1830 Title: Zooplankton dynamics in a lowland river along temporal and spatial gradients Authors: Bertani, Isabella Abstract: Studies on zooplankton ecology have traditionally dealt with lentic systems, while research on lotic assemblages has lagged far behind. It is especially in the last decades that riverine zooplankton has become the focus of an increasing number of investigations, showing that large lowland rivers often host extremely rich and abundant plankton communities. Surveys conducted in rivers all over the world highlighted the major role played by abiotic constraints in shaping the development of riverine zooplankton, while much fewer studies have dealt with biotic factors, which are generally thought to play a minor role in the main current of rivers. Despite this growing amount of research, questions still remain to be answered regarding the origin of river plankton, how these communities are able to persist in the current and the major mechanisms involved in regulating their spatio-temporal dynamics. The present work deals with different aspects of the ecology of zooplankton in a large lowland river (Po River, Northern Italy). A multi-level approach was adopted, combining different surveys carried out at distinct spatial and temporal resolutions, based on the following main research questions: 1. What are the main abiotic and biotic factors controlling the spatio-temporal dynamics of zooplankton abundance and composition in the potamal reach of a lowland river? What is the effect of disturbance events like floods on community structure? Is the community able to exhibit regular successional patterns? These research topics have been addressed by means of a two-year sampling campaign carried out in the potamal reach of the Po River. Results confirmed the role of abiotic constraints related to seasonality and hydrology, together with that of trophic conditions, as the major drivers of zooplankton dynamics. The comparison of two hydrologically different years suggested that the uncoupling between seasonality and hydrology can significantly influence community density and diversity temporal patterns. The relationship between discharge and zooplankton abundance is not univocally negative, as increases in river flow may at times bring about a net increment of the assemblage, when resuspension of organisms from the river bottom and/or littoral zones prevails over advective losses. Discharge fluctuations strongly affect zooplankton diversity too, both taxonomical and functional, with higher diversity associated with increases in river flow, up to a threshold over which destructive effects dominate. However, the impact of hydrodynamic forcings in shaping lotic zooplankton appears to lose importance in favour of that of seasonality and trophic state when moving down the longitudinal dimension of the river system, and a clear downstream shift towards a truly planktonic community occurs, especially during summer low-flow conditions. 2. Can biotic interactions (predation/competition) within the zooplankton become crucial drivers of community structure under advective conditions? A short-term, high-frequency sampling campaign was carried out in summer 2005 in the potamal stretch of the Po River. To test for the presence of association patterns among zooplankters, which might be suggestive of potential trophic interactions (predation/competition), taxa were aggregated into functional groups according to their feeding ecology, and time series of their abundances were analysed by means of a variance ratio test and multivariate autoregressive models, which revealed the occurrence of compensatory dynamics among functional groups under low and stable, although truly advective, discharge conditions. Evidence on the importance of predator-prey interactions and intra-population regulation mechanisms also came from further analyses on the dominant predator's gut contents and on its main prey's population dynamics. Results showed that, under certain conditions, zooplankton is able to exhibit internal, self-regulatory mechanisms also in the main current of a large river and the view of riverine zooplankton as a mere assemblage of taxa exclusively abiotically controlled is therefore oversimplified. 3. What are the main changes within the plankton community during its downstream transport and how can the observed longitudinal dynamics be explained? What is the contribution of the major tributaries to the main channel zooplankton assemblage? These questions have been addressed by means of a Lagrangian sampling experiment carried out in May 2010 on a 330-km river stretch. Results highlighted how water residence time under spring conditions is too short to allow longitudinal development of zooplankton, which is merely transported downstream without significant changes in abundance and composition. One of the tributaries, the Mincio River, hosted an exceptionally abundant zooplankton community, which resulted in a significant increase in total zooplankton densities in the Po River downstream of its inflow. The Mincio lower course is highly regulated and artificially modified. The result is a system where current is extremely impaired and slowed down, creating favourable conditions for phyto- and zooplankton massive development. As a consequence, the influence of this tributary on the Po River zooplankton during the survey was still detectable as far as 100 km downstream of its mouth and the community composition recorded downstream of the Mincio inflow was more similar to the assemblage found in the tributary than to that found at the upstream stations of the Po River itself. 4. Does the presence of an hydrological discontinuity along the river course, such as a man-made reservoir, induce relevant changes in zooplankton composition and abundance? Are there significant differences in community structure along cross-channel transects (middle channel versus river banks) or is the river a completely well-mixed environment with homogeneously distributed plankton assemblages? A sampling campaign was carried out in summer 2009 at four stations respectively upstream, inside (mid-channel vs. shore) and downstream of the artificial impoundment of Isola Serafini, located in the middle reach of the Po River. The study revealed that longitudinal and lateral hydrogeomorphic heterogeneity may affect community abundance and diversity, so that the assemblage found at one site along the river may also be related to local hydroecological features and not only to processes taking place further upstream. However, in a rectified and channelized river like the Po, this appears to be the case only at extremely low discharge rates and high water residence time. Results of the surveys carried out along extremely artificialized traits of both the Po River (Isola Serafini dam) and its tributaries (lower section of the Mincio River) showed how anthropogenic modifications of the river's natural hydrogeomorphic features may have strong impacts also on biotic components that are usually overlooked by standard monitoring programs, even though their role in the functioning of lotic systems is still not completely understood. Sat, 31 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1830 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1701 Title: Verso un vaccino autoadiuvante multivalente contro il virus del papilloma umano Authors: Canali, Elena Abstract: La scoperta che l’infezione persistente da tipi oncogeni del virus del papilloma umano (HPV) è causa necessaria per l’insorgenza di neoplasia cervicale ha guidato lo sviluppo di strategie di prevenzione primaria. Nonostante la dimostrata efficacia dei vaccini attualmente in commercio contro infezioni dai sierotipi più comuni di HPV, la limitata multivalenza contro tipi virali non inclusi nelle formulazioni, l’elevato costo di ciascuna dose e la necessità di personale paramedico per la somministrazione, rendono necessario lo sviluppo di preparati di seconda generazione. La presente ricerca, nata dalla collaborazione tra il Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell’Università degli Studi di Parma, ‘International Agency for Research on Cancer’, WHO (Lione) e ‘German Cancer Research Center’ (Heidelberg), si è posta come obiettivo lo sviluppo di un vaccino economico, stabile e in grado di fornire una protezione a lungo termine a livello mucosale contro la maggiorparte dei tipi oncogeni di HPV. Nella prima fase della ricerca è stata esaminata l’immunogenicità e il potenziale di neutralizzazione virale di sei peptidi appartenenti alla regione N-terminale della proteina capsidica minore L2 (aa 1-120) di HPV16, utilizzando la proteina batterica Tioredossina (Trx) come scaffold strutturale. La strategia TDMI (Thioredoxin Displayed Multipeptide Immunogens) utilizzata, ha permesso l’identificazione dell’antigene ricombinante trimerico Trx-L2(20-38) come il miglior candidato per lo sviluppo di un vaccino cross-protettivo. Questo infatti si è rivelato un eccellente immunogeno, in grado di indurre non solo una forte risposta immunitaria, ma anche la produzione di anticorpi a protezione crociata in grado di neutralizzare fino a quattro diversi sierotipi virali, inclusi quelli a più alta cancerogenicità (HPV 16, 18, 58, 45). Avendo identificato l’antigene più promettente, la fase successiva ha riguardato l’ulteriore ottimizzazione dello stesso in vista di una sua utilizzazione come vaccino peptidico ricombinante. La dimostrazione che la porzione di epitopo effettivamente riconosciuta dagli anticorpi monoclonali, prodotti a partire dai topi precedentemente immunizzati, era quella compresa tra gli aminoacidi 20 e 31, ha portato alla generazione di antigeni ‘miniaturizzati’ costituiti dalla fusione della Trx con più copie dell’epitopo ridotto, con l’obiettivo di indurre una maggiore focalizzazione del sistema immunitario e quindi di potenziare ulteriormente la performance del vaccino in termini di cross-neutralizzazione. Con lo stesso scopo, sono state progettate proteine potenzialmenti multivalenti, presentanti diverse combinazioni strutturali dell’epitopo candidato di differenti sierotipi virali. Nota l’importanza di particolari ponti disolfuro per l’infettività dei virioni, è stata inoltre valutata l’immunoreattività dei monoclonali verso la forma ossidata o artificialmente ridotta dell’antigene Trx-L2(20-38) in esame, al fine di incrementare il potere neutralizzante degli anticorpi generati. L’ulteriore miglioramento dell’immunogeno candidato è stato diretto alla realizzazione di derivati ad elevata stabilità termica e conformazionale, con costi di produzione il più possibile ridotti, in grado di garantire una risposta immunitaria di lunga durata, con un numero minimo di somministrazioni. Tali obiettivi sono stati perseguiti valutando, da una parte, le proprietà di scaffold molecolare di varianti della Tioredossina provenienti da batteri ipertermofili, dall’altra esaminando la performance immunologica, soprattutto in termini di immunogenicità e capacità autoadiuvante, di proteine chimeriche contenenti forme modificate della Trx fuse alla Flagellina (Fli), uno dei più potenti stimolatori dell’immunità innata. Oltre alla fusione Fli-Trx di Escherichia coli già disponibile, sono stati realizzati costrutti chimerici della Flagellina di Salmonella typhi, con la Trx posta in una posizione più apicale e quindi verosimilmente più esposta. Le corrispondenti proteine di fusione verranno somministrate in animali da laboratorio in diverse formulazioni (con e senza adiuvante) per valutare l’effettiva potenzialità adiuvante della Flagellina. La presente ricerca si è inoltre posta come obiettivo secondario e futuro la valutazione di vaccini TDMI alternativi potenzialmenti autoadiuvanti, tra i quali i vaccini ‘vivi’ in ospiti batterici approvati per uso umano (e.g., Salmonella typhi) e strutture sovramolecolari ottenute utilizzando la parete di batteri lattici, non viventi e non geneticamente modificati, come sistemi di display di multiple copie dell’antigene. L’analisi della risposta immune generata negli animali vaccinati, a cui le differenti formulazioni verranno somministrate mediante metodiche alternative (orale e intranasale) all’iniezione, fornirà importanti indicazioni circa l’approccio migliore per fornire una protezione più efficace e duratura contro il virus del papilloma umano, con l’obiettivo finale di sviluppare un vaccino di seconda generazione, multivalente, auto-adiuvante e a basso costo. Mon, 28 Feb 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1701 2011-02-28T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1700 Title: Metodologie molecolari per l'analisi OGM in matrici alimentari "food and feed" Authors: Campioli, Daniel Abstract: L’evoluzione del mercato mondiale degli organismi geneticamente modificati, e di conseguenza delle normative collegate ad esso, rende necessario uno studio approfondito sulle metodiche di analisi di queste matrici. Le normative di diversi paesi rende obbligatoria la tracciabilità e l’etichettatura dei prodotti alimentari “food and feed” contenenti OGM. Il lavoro svolto in questo dottorato di ricerca si è quindi basato sullo studio delle metodologie utilizzate per l’analisi di matrici alimentari contenti OGM, tramite l’applicazione della Food Genomics, intendendo con questo termine l’applicazione degli studi sul genoma degli organismi da cui si ricavano le materie prime per stabilire l’autenticità degli alimenti. Il primo passo è stato di definire un protocollo d’estrazione del DNA per un’analisi della degradazione del materiale genetico estratto da pellet di mangime, che simulano la composizione del classico mangime ad uso zootecnico, formato da mais, soia, girasole, orzo e crusca. Questi pellet sono stati conservati a temperatura ambiente, 4°C e -20°C al fine di verificare lo stato di degradazione a diverse temperature. Le estrazioni di DNA sono state effettuate con un metodo CTAB specifico per farine, effettuando una prima estrazione a tempo T0, una seconda dopo 3 settimane, una terza dopo 6 mesi e l’ultima dopo 18 mesi. L’analisi della resa in termini di DNA estratto mostra che l’estraibilità del DNA viene mantenuta per tutte le quattro estrazioni denotando però un calo del materiale estratto con l’avanzare del tempo di conservazione, e che lo si nota soprattutto nelle condizioni di stoccaggio a temperatura ambiente. Lo stesso metodo è stato applicato per l’estrazione di DNA da prodotti commerciali per verificare la presenza di OGM. Per effettuare un altro controllo è stato utilizzato un kit commerciale d’estrazione del DNA da tessuti e apparati di pianta di mais (foglia, brattea, stocco, radici, cariosside, trinciato, ovario), come confronto con il metodo CTAB. E’ stato effettuato un confronto fra le metodiche della Food Genomics con quelle che utilizzano le proteine tramite un’analisi di farine di mais e soia con lateral flow devices. Con la soia si sono utilizzati dei lateral flow devices commerciali mentre con il mais dei lateral flow devices sviluppati nel progetto COEXTRA. Il confronto dei dati ottenuti dall’analisi proteica con una successiva analisi di PCR, ha confermato che la sensibilità delle lateral flow strip è più ridotta di quelle delle metodologie di PCR. Il passo successivo è stato di applicare al DNA estratto un analisi in PCR real-time sulle matrici precedentemente descritte, che è la metodologia d’elezione applicata nel campo della Food Genomics e dell’analisi di OGM. Nello studio della degradazione del DNA, è stata effettuata una PCR real-time con chimica TaqMan per la verifica dell’amplificazione del gene di mais endogeno zeina, che ha confermato la stabilità e l’amplificabilità del gene nelle varie condizioni analizzate. Con il DNA estratto tramite kit commerciale da vari organi della pianta di mais è stata applicata una PCR real-time duplex con i due geni endogeni zeina e alcol deidrogenasi e il costrutto transgenico Mon810. La PCR real-time duplex è risultata efficace su tutti i tessuti analizzati sia per zeina/Mon810 che per Adh/Mon810. Per il prodotto commerciale, la verifica della presenza di materiale OGM è avvenuta prima tramite analisi in PCR end-point con primer specifici per i geni endogeni zeina e lectina e per il promotore 35S, comunemente presente nei costrutti transgenici, dando origine per lotti diversi a diversi risultati di amplificazione. I campioni positivi sono stati analizzati successivamente in PCR real-time con chimica e quindi verificati in base alla Tm degli ampliconi ottenuti. Il DNA estratto è stato controllato anche con primer specifici per i costrutti transgenici EPSPS e Mon810 sempre in real-time SYBER® GreenerTM, confermando la presenza a bassi livelli di materiale transgenico. Fri, 31 Dec 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1700 2010-12-31T23:00:00Z