http://hdl.handle.net/1889/634 Tue, 18 Jun 2013 05:51:25 GMT 2013-06-18T05:51:25Z http://hdl.handle.net/1889/1940 Title: Studi di caratterizzazione del meccanismo di azione del proteoglicano NG2/CSPG4 nella sclerosi multipla Authors: Ferrara, Giovanni Abstract: Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Although the events triggering MS are still unknown, T lymphocytes reactive toward the myelin sheath are thought to have a prominent role. The myelin sheath is the most abundant membrane structure in the vertebrate nervous system. Its unique composition and its unique segmental structure is responsible for the saltatory conduction of nerve impulses which allow the myelin sheath to support the fast nerve conduction in the thin fibers of the vertebrate system. Oligodendrocytes (OLs), a special class of glial cells, are essential for myelin production and organization; in fact, myelin is a spiral extension of the plasma membrane of OLs. OLs are terminally differentiated and originate from neuro-epithelial stem cells localized in the sub-ventricular zone (SVZ). The OLs lineage is well characterized, SVZ stem cells proliferate and lead to glial-restricted (GR) progenitors and then to oligodendrocyte precursor cells (OPCs), finally to mature oligodendrocytes. The OPCs, are activated during inflammation and mediate remyelination in MS patients even if in an inefficient way. Characterization by biochemical markers such as NG2 proteoglycan has been a specific tool to study the OLs maturation steps in both in vivo and in vitro experiment. Nerve-glial antigen 2 (NG2), the product of the CSPG4 gene, is a single membrane-spanning chondroitin sulphate proteoglycan with a large extracellular domain and a short cytoplasmic tail. NG2 is expressed not only by OPCs but also by vascular mural cells, including pericytes in the CNS, that form the Neuro-vascular unit (NVU) together with blood-brain barrier (BBB). There are numerous functions attributed to NG2: several studies have shown the involvement in cell-cell and cell-extracellular matrix adherence. In contrast, little is known about NG2 function in the CNS and in particular on OPC cells. This work was focused on the study of NG2 in the CNS and our hypotheses are: • Since the pathology is characterized by a relevant autoimmune component, we hypothesize that NG2 proteoglycan may be involved in the abnormal immune response typical of MS; • Regarding NG2 expression in OPCs and pericyte cells, we hypothesize that these cells are involved in disease progression. First of all, to investigate the role of NG2 antigen, we analyzed CSF samples of MS patients appropriately collected and classified, to find auto-antibodies against NG2 through ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) experiments. We verified the presence of auto-antibodies by western blot and correlated the experimental data with the MS patients clinical values. Again, we found a MS patient subset positive for NG2 autoantibodies and these patients show a more severe disease. Finally, we propose autoantibodies against NG2 as a prognostic biomarker. To characterize the role of NG2 in OPCs and pericyte cells, we utilized an animal model of MS (EAE, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, obtained with MOG immunization), in NG2 knock-out (NG2-KO) mice. In NG2 KO, MOG immunization largely failed to produce a substantial demyelinization phenotype and manifestation of disease was overall markedly attenuated, compared to WT. To understand the mechanisms involved in NG2-KO protection from EAE, several approaches were performed. Histological analysis was done and infiltrated cells (macrophages and T-cells) were counted. Compared to WT EAE affected mice, analysis showed an important reduction in demyelination in NG2-KO EAE affected mice. Further histological analysis of CNS spinal cord sections demonstrated a reduced number of IBA1-positive macrophages in NG2KO mice. About T-cells, no significant difference was observed in the number of infiltrated, but proliferation of stimulated (anti-CD3) T-cells from NG2-KO was significantly lower, compared to WT. Cytokines production in in vitro analysis of stimulated T-cells showed different expression in NG2 KO compared to WT, in fact INFγ, IL-17 and IL-4 mRNA levels were up-regulated. About mRNA levels analysis on dendritic cells (DCs), IL-12 was down-regulated and TNFα was up-regulated, but no differences was show on DCs maturation after LPS stimulation. The OPCs analysis in SNC of NG2 KO EAE affected mice, showed the same number of cells compared to in naïve NG2, while in WT-EAE affected mice, the number of OPCs was dramatically lower than the naïve WT. We also analyzed the NVU structure, studying the expression of Claudin-5 and Occludin BBB proteins. Prior to MOG immunization, the expression of all two markers was decreased in naïve NG2-KO mice, compared to wild type mice. However, during the disease phase we observed an increase in the two markers in NG2 null mice to a level comparable to WT mice prior to MOG challenge. On the basis of results from our laboratories, we believe that the absence of NG2 can influence the course of disease in a protective way. Sat, 31 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1940 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1931 Title: Bitter taste receptors and gastrointestinal chemosensing in mice Authors: Vegezzi, Gaia Abstract: Il sistema digerente è un organo sensorio capace di riconoscere le sostanze presenti nel lume e di iniziare un’ adeguata risposta, che si traduce in digestione ed assorbimento per i nutrienti o eliminazione per le sostanze nocive. E’ stato dimostrato che i recettori per l’amaro (T2R), un’ampia famiglia di GPCR in grado di riconoscere composti amari nella bocca, così come le molecole coinvolte nella trasduzione del segnale, sono espressi a livello della mucosa intestinale. Poiché l’amaro si è evoluto come un meccanismo di allarme nella bocca, proponiamo che i T2R nel sistema gastrointestinale possano servire come un secondo livello di difesa verso composti nocivi. In questo studio abbiamo usato qRT-PCR per stabilire la distribuzione di due sottotipi recettoriali dei T2R (mT2R138 e mT2R108), e della loro subunità Gα-Gustducin (Gust), nel sistema digerente del topo, e varie diete sono state usate per vedere se il contenuto del lume è in grado di modulare i recettori dell’amaro. Per testare l’ipotesi che i T2R nel sistema digerente possano servire come meccanismo di difesa nei confronti di patogeni, in ulteriori studi si è misurato tramite WB il grado di fosforilazione della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK p44/42) per valutare se i T2Rs rispondano ad acil-omoserin-lattoni, molecole prodotte da batteri Gram negativi. La risposta, valutata su cellule STC-1 e NCM-460, è stata confrontata con quella evocata da agonisti per i T2R_feniltiocarbamide (PTC) e denatonio benzoato (DB)_e bloccata dall’antagonista del recettore T2R138, Probenecid. Il meccanismo che segue l’ attivazione dei T2R è stato ulteriormente caratterizzato con l’uso di GF-1, un inibitore della proteina chinasi C, e di nitrendipina, un bloccante dei canali calcio. Questo studio dimostra che mT2R138, mT2R108 e Gust sono espressi lungo tutto il sistema digerente, con diversa abbondanza, e che diverse diete sono in grado di modulare specificamente alcuni recettori, in aree selezionate lungo il sistema digerente. Abbiamo anche dimostrato che sia la linea cellulare umana di colonociti NCM-460, sia la linea di cellule enteroendocrine di topo STC-1 esprimono T2R e rispondono allo stimolo del gusto amaro e ad AHL con una rapida fosforilazione della MAPK p44/42, mostrando un profilo dose-dipendente. Il segnale indotto da PTC e AHL è bloccato dal Probenecid e ridotto dal GF-1, ma non dalla nitrendipina, al contrario del segnale indotto dal DB. Inoltre, l’esposizione delle cellule NCM-460 per 4-24 ore a PTC o AHL induce un aumento significativo dell’espressione del recettore T2R38 umano, omologo del T2R138 nel topo. In conclusione, questo lavoro di tesi propone che i T2R siano coinvolti nell’abilità sensoria del sistema gastrointestinale e che possano esistere diverse funzioni a seconda del sottotipo recettoriale espresso, del sito di espressione e del meccanismo utilizzato. Abbiamo mostrato che diversi tipi di cellule di origine intestinale esprimono diversi sottotipi di T2R e che essi possano usare diversi meccanismi. Inoltre, suggeriamo che i T2R possano interagire con batteri nel sistema gastrointestinale, a supporto dell’ipotesi per cui i recettori dell’amaro costituiscono un secondo livello di difesa nel sistema gastrointestinale, in grado di iniziare una risposta infiammatoria per combattere i batteri patogeni presenti nel lume.; The gastrointestinal (GI) tract is a chemosensory organ that detects nutrients in the lumen to initiate an appropriate response of digestion and absorption of nutrients or elimination of harmful substances. It has been shown that bitter taste receptors (T2Rs), a large family of GPCRs detecting bitter compounds in the mouth, and their signaling molecules, are also expressed in the GI tract mucosa. Because bitter taste has evolved as a warning mechanism in the mouth, we hypothesize that T2Rs in the GI tract might serve as a second level of defense towards harmful compounds. In this study, we used qRT-PCR to investigate the distribution of two T2Rs subtypes (mT2R138 and mT2R108), and their signaling molecule Gα-Gustducin (Gust), in the mouse GI tract, and different diets to see whether they are modulated by luminal content. To test the hypothesis that T2Rs in the gut might serve as a mechanism of defense against pathogens, additional studies measured by WB the phosphorylation of mitogen activated protein kinase (MAPK) to evaluate whether T2Rs respond to Acyl Homoserine Lactone (AHL), quorum sensing molecule for Gram negative bacteria. The response on STC-1 and NCM-460 cells was compared to the ones elicited by T2Rs agonists_phenylthiocarbamide (PTC) and denatonuim benzoate (DB)_and blocked by the T2R138 antagonist Probenecid. The pathway following T2Rs activation was further characterized using GF-1, a protein kinase C inhibitor, and nitrendipine, a Ca++ channel blocker. We found that mT2R138, mT2R108 and Gust are expressed throughout the entire mouse GI tract, with different levels of expression, and that different diets selectively modulate T2Rs in specific GI regions. Also, we showed that both NCM-460 human colonocytes and STC-1 mouse enteroendocrine cells express T2Rs and respond to bitter stimuli and AHL with rapid dose-dependent phosphorylation of MAPK p44/42. PTC and AHL-induced signal was blocked by Probenecid and reduced by GF-1, but not by nitrendipine, in contrast with DB-induced MAPK phosphorylation. Furthermore, exposure of NCM-460 cells to PTC or AHL for 4-24 h induced a significant increase in hT2R38 mRNA, the homologus of mT2R138. In summary, these data suggest that T2Rs are involved in chemosensing in the GI tract and that different functions might exist depending upon receptor subtype, site of expression and molecular mechanism. We showed that different T2R subtypes are expressed in different GI cell types and that they might use different pathways. Also, we suggest that T2Rs might detect bacterial stimuli in GI cells, supporting the hypothesis that activation of these receptors might provide a second level of defense in the GI mucosa to initiate an inflammatory process in response to bacteria in the gut lumen. Thu, 29 Mar 2012 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1931 2012-03-29T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1930 Title: Alterazioni funzionali e strutturali nel microcircolo periferico indotte da angiotensina II: ruolo delle ciclo-ossigenasi ed effetti di rosuvastatina Authors: Rugani, Ilaria Abstract: L’ipertensione arteriosa è caratterizzata da alterazioni strutturali e funzionali a livello delle piccole arterie di resistenza, come conseguenza di un processo di crescita delle miocellule (rimodellamento ipertrofico) o di riarrangiamento dello stesso tessuto intorno ad un lume più piccolo (rimodellamento eutrofico). Le alterazioni funzionali sono legate alla disfunzione endoteliale, mentre le alterazioni strutturali dipendono dalla fibrosi vascolare. L’angiotensina (Ang) II è coinvolta nello sviluppo e nella progressione di queste alterazioni funzionali e strutturali nelle piccole arterie di resistenza, come dimostrano numerose evidenze cliniche e sperimentali. La fibrosi rappresenta un importante fenomeno associato all’ipertensione indotta da Ang II ed è caratterizzata dalla modificazione dei componenti della matrice extracellulare (ECM), tra i quali il collagene di tipo I e III, la fibronectina e l’elastina. La ciclo-ossigenasi (COX)-1 e i prostanoidi da essa prodotti sono coinvolti nella disfunzione endoteliale indotta da Ang II. E’ noto infatti che l’infusione cronica di Ang II si associa ad una aumentata espressione/attività di COX-1 intravascolare, con conseguente iperproduzione di prostanoidi vasoattivi che agiscono sui recettori TP delle cellule muscolari lisce. Recenti studi hanno inoltre dimostrato che il sistema COX-1 è coinvolto anche nello sviluppo e progressione del danno aterosclerotico vascolare. Nella prima parte del presente progetto di ricerca è stato valutato il contributo di COX-1 e dei prostanoidi attivi sui recettori TP sulle modificazioni morfologiche e sulle componenti della ECM che caratterizzano il rimodellamento vascolare nelle piccole arterie di resistenza di topi trattati cronicamente con Ang II. Gli esperimenti sono stati condotti su topi C57BL/6J maschi di 12-14 settimane di età, omozigoti per delezione genetica del gene COX-1 (COX-1-/-) o wild-type (WT) dello stesso ceppo, sottoposti ad infusione con Ang II. Tre gruppi di topi WT sottoposti a infusione cronica con Ang II sono stati inoltre trattati con SC-560 (inibitore selettivo di COX-1), DFU (inibitore selettivo di COX-2) e SQ-29548 (antagonista del recettore TP del trombossano) per 2 settimane. Le arterie mesenteriche, isolate da questi animali, sono state sottoposte a valutazione della reattività vascolare con l’ausilio del miografo a pressione, allo scopo di determinare i parametri strutturali del vaso (spessore tonaca media, diametro del lume, rapporto media lume e area trasversa della media). Inoltre, è stata quantificata la deposizione di collagene e fibronectina mediante analisi immunoistochimica e di elastina mediante analisi istochimica. L’espressione di COX-1 e COX-2 nelle arterie mesenteriche è stata valutata tramite analisi RT-PCR e Western Blot. Infine, sono stati analizzati i prodotti derivanti da COX-1, coinvolti nelle alterazioni vascolari indotte da Ang II. I risultati ottenuti dimostrano che Ang II induce un rimodellamento ipertrofico vascolare, un aumento nel deposito di collagene e fibronectina, e una riduzione di elastina. Questi effetti sono antagonizzati da SC-560 e SQ-29549, ma non da DFU. Inoltre, gli effetti di Ang II non risultano più evidenti nei topi COX-1 KO. Negli animali WT Ang II aumenta l’espressione di COX-1 e riduce l’espressione di COX-2, con un incremento concomitante della produzione tissutale di 6-keto-PGF1che è bloccata dall’inibizione di COX-1. Questi risultati suggeriscono che il rimodellamento vascolare indotto da Ang II sia, almeno in parte, mediato dall’attivazione di COX-1 e dalla successiva produzione di prostanoidi che agiscono sui recettori TP. Questi dati sono sostenuti dai risultati ottenuti nei topi COX-1-KO, nei quali non è stato osservato alcun effetto da parte di Ang II nel rimodellamento vascolare. E’ quindi possibile ipotizzare che il sistema della COX-1 sia coinvolto nella progressione ed evoluzione dell’aterosclerosi, in particolare in quelle forme di ipertensione caratterizzate da una marcata attivazione del sistema renina-angiotensina-aldosterone. Nella seconda parte dello studio, sono stati valutati gli effetti di rosuvastatina sulla disfunzione endoteliale e sul rimodellamento vascolare nelle arterie mesenteriche di resistenza di ratti con ipertensione indotta da Ang II, con particolare riguardo per il ruolo di COX-1. Gli esperimenti sono stati condotti su ratti maschi Sprague-Dawley sottoposti ad infusione con Ang II. Inoltre, gli animali sono stati trattati con rosuvastatina o placebo per due settimane. Lo studio della reattività vascolare è stato eseguito utilizzando la tecnica della micromiografia a pressione La vasodilatazione endotelio-dipendente è stata valutata mediante infusione di acetilcolina (ACh), in assenza o in presenza di SC-560, Dup-697 (inibitore selettivo di COX-2) o SQ-29548. La disponibilità di ossido nitrico (NO) è stata valutata in presenza dell’inibitore della NO sintetasi, L-NAME. Dal punto di vista funzionale, il ruolo dello stress ossidativo intravascolare è stato studiato incubando il vaso con acido ascorbico, mentre a livello sistemico è stata valutata la produzione intravascolare di anione superossido mediante tecnica a fluorescenza del diidroetidio e la concentrazione plasmatica di malondialdeide. Inoltre, è stata quantificata la deposizione di collagene e fibronectina mediante analisi immunoistochimica, e di elastina mediante analisi istochimica. Il ruolo di COX-1 e della NADPH ossidasi sulla deposizione di collagene indotta da Ang II è stato esaminato trattando gli animali con SC-560 e apocianina (inibitore di NADPH ossidasi). Nelle arterie mesenteriche è stata valutata anche l’espressione dell’mRNA codificante per COX-1 tramite RT-PCR. Infine, sono stati esaminati i livelli dei prodotti derivanti da COX-1, coinvolti nelle alterazioni vascolari indotte da Ang II. In presenza di tali condizioni sperimentali, rosuvastatina si è dimostrata in grado di normalizzare le alterazioni funzionali e strutturali dei vasi, migliorando la biodisponibilità di NO, riducendo la produzione di anione superossido, determinando una riduzione nel deposito di collagene e fibronectina ed un concomitante aumento del contenuto di elastina nella tonaca media vascolare, attraverso l’inibizione intravascolare di NADPH ossidasi e una simultanea riduzione della produzione di prostanoidi derivanti da COX-1. In conclusione, i risultati ottenuti in questo progetto di ricerca forniscono informazioni importanti sui meccanismi responsabili delle alterazioni indotte da Ang II nelle piccole arterie di resistenza. In particolare, emerge un processo di rimodellamento vascolare, caratterizzato da modificazioni nella composizione della ECM, che sono in parte dipendenti dall’attivazione di COX-1 e successiva produzione di prostanoidi vasocostrittori in grado di agire sui recettori TP. Questi meccanismi contribuiscono al danno aterosclerotico derivante da Ang II. Inoltre, i presenti risultati dimostrano che il trattamento con rosuvastatina previene la disfunzione endoteliale, il rimodellamento vascolare e le modificazioni della ECM. Queste evidenze possono avere rilevanza clinica in quanto le statine possono prevenire la progressione del danno cardiovascolare, in particolare nelle forme di ipertensione umana caratterizzata da elevata attività del sistema renina-angiotensina-aldosterone. Sat, 31 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1930 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1623 Title: Studio del ruolo dei geni ApoE e ACAT2 sull’eziopatogenesi dell’aterosclerosi e potenziale intervento farmacologico Authors: Stomeo, Grazia Abstract: Il lavoro esposto in questa tesi di dottorato consta di tre studi fondamentali. Nel primo studio è stato stimato il contributo macrofagico e sistemico dell’apolipoproteina E attraverso l’RCT, inizialmente valutato in topi WT iniettati con macrofagi WT o apoE-/-. L’assenza della proteina nei macrofagi causa una significativa riduzione nel contenuto di colesterolo rilasciato nel plasma, nel fegato e nelle feci. Al contrario, l’espressione dell’apoE nei macrofagi è sufficiente a promuovere un normale RCT anche nei topi in cui tale proteina è assente. Anche valutando l’efflusso cellulare di colesterolo, step limitante l’RCT, sono stati confermati i dati riscontrati nell’analisi in vivo. Per la prima volta è stato quindi dimostrato che l’assenza a livello macrofagico dell’apolipoproteina E compromette significativamente il meccanismo di RCT macrofagico in vivo nei topi. Il secondo studio ha evidenziato il ruolo chiave dell’ACAT2 epatica nel metabolismo delle HDL nei topi. Quando l'attività epatica dell’ACAT2 è ridotta, il colesterolo libero sembra essere incanalato in modo preferenziale sull’apoA-I, proteina up-regolata da ABCA1. Questo sembra comportare una modifica positiva sulla distribuzione e sulla funzionalità delle particelle HDL. Attraverso l’analisi bi-dimensionale su gel è stato dimostrato che in topi LXRα/β-/-, la down-regulation dell’ACAT2, mediante l’uso di ASO6 oligonucleotide anti-senso, aumenta notevolmente il contenuto delle pre-β-HDL e induce la comparsa di piccole α-HDL, contrariamente ai topi WT. Sulla base di ciò è stata valutata la capacità dei sieri di topi trattati con ASO6 di promuovere l'efflusso di colesterolo cellulare. I sieri di topi WT trattati con ASO6 hanno mostrato un aumento del potenziale di efflusso per diffusione passiva e SR-BI, mentre i sieri dei topi LXRα/β-/- trattati con ASO6 hanno una maggiore capacità di accettare colesterolo da parte dell’efflusso ABCA1-mediato. È risaputo come gli antagonisti dei canali del calcio e gli inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina siano capaci di ridurre l'insorgenza e la progressione dell'aterosclerosi. Nel terzo studio è stato pertanto valutato il contributo dell’associazione tra manidipina/delapril nel prevenire o ridurre lo sviluppo di aterosclerosi in topi apoE-/ -. Il contenuto di lipidi misurato nelle valvole cardiache e i livelli di colesterolo nell'intera aorta sono ridotti negli animali riceventi l'associazione dei farmaci. Risulta rilevante l’effetto anti-infiammatorio su VCAM-1 e IL-6, ma non è possibile evidenziare l'efficacia dell’associazione manidipina/delapril sulle lesioni aterosclerotiche in questi modelli murini. Fri, 31 Dec 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1623 2010-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1596 Title: Ricerca e caratterizzazione di ligandi per efrine chinasi coinvolte nei processi tumorali Authors: Giorgio, Carmine Abstract: I recettori tirosin chinasici Eph e i loro ligandi, le efrine, giocano un ruolo importante in un ampio numero di neoplasie umane. Al fine di identificare piccole molecole in grado di interferire con il legame Eph-ephrin abbiamo messo a punto un saggio di legame di tipo ELISA. Il successivo studio di screening è stato condotto su una “in house library” e ha portato all’identificazione dell’acido litocolico (LCA) come ligando competitivo del sitema efrinico. Come i ligandi e i recettori efrinici, che in generale sono in grado di legarsi in maniera promiscua, anche LCA non ha mostrato selettività nell’inibizione di legame quando testato verso i diversi recettori e ligandi efrinici. Acidi biliari strutturalmente correlati ad LCA invece, sono risultati essere completamente inattivi sia in studi di binding che funzionali. Al contrario LCA ha dimostrato di inibire la fosforilazione di EphA2 dopo stimolazione con ephrinA1-Fc in studi funzionali condotti sulle linee cellulari PC3 e HT29. Alle dosi impiegate il composto è risultato essere non citotossico e inattivo nei confronti di altri recettori tirosin chinasici (EGFR, VEGFR, IGFR, IRK) sia quando testato come agonista che quando impiegato come antagonista. Inoltre LCA è risultato essere inattivo quando utilizzato come inibitore del dominio chinasico di EphA2 confermando quindi di interagire con l’interfaccia Eph-ephrin. Infine LCA è stato in grado di inibire la retrazione EphA2 dipendente e ephrinA1 indotta delle cellule PC3. Il nostro lavoro di ricerca dunque dimostra che l’interfaccia Eph-ephrin può essere modulata da piccole molecole e offre un modello sperimentale che potrebbe essere utile per lo sviluppo di composti interagenti con il sistema efrinico. Inoltre siccome i segnali mediati dal sistema efrinico sono una componente chiave nel rinnovamento cellulare intestinale organizzato, il nostro lavoro potrebbe fornire un interessante punto di partenza per ulteriori indagini circa il ruolo di questo acido biliare secondario nell’omeostasi intestinale. Fri, 31 Dec 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1596 2010-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1588 Title: Contributo dell'istamina e delle proteasi seriniche nel danno post-ischemico intestinale Authors: Gobbetti, Thomas Abstract: L’ischemia mesenterica acuta è una condizione patologica causata dallo scompenso tra la perfusione di ossigeno al distretto intestinale da una parte e la domanda metabolica tissutale dall’altra. L’incidenza in aumento nel corso di questi ultimi anni, l’eziologia multifattoriale, la complessità della patogenesi e la mancanza di terapie risolventi riservano a questa patologia una posizione di rilievo negli attuali studi di ricerca. In questo lavoro di tesi in un modello sperimentale di ischemia e riperfusione intestinale nel topolino è stato indagato il ruolo svolto dall’istamina nella patogenesi del danno associato ad una condizione di ischemia mesenterica acuta. La principale fonte intestinale di istamina è rappresentata dalla degranulazione dei mastociti mucosali. I risultati hanno dimostrato che il trattamento con il Cromolyn, uno stabilizzatore dei mastociti, ha esercitato un effetto protettivo sul reclutamento granulocitario che segue un evento ischemico intestinale. Sulla base di queste indicazioni, sembra logico ritenere che l’istamina liberata in risposta alla degranulazione dei mastociti possa contribuire alla patogenesi del danno da ischemia e riperfusione intestinale. Infatti, abbiamo evidenziato che l’istamina svolge un ruolo determinante durante le prime ore di riperfusione mediante l’attivazione del recettore H4 il cui blocco è il solo in grado di svolgere un effetto protettivo e preventivo nei confronti della chemiotassi dei granulociti neutrofili. Nel presente lavoro, in un analogo modello di infiammazione intestinale, è stato dimostrato che anche le proteasi svolgono un ruolo decisivo nella patogenesi di questa malattia. Infatti, è stata rilevata un’aumentata attività serin-proteasica nel plasma e nel tessuto intestinale associata al danno da ischemia e riperfusione. L’inibizione di questa attività protegge l’intestino dall’infiltrazione granulocitaria post-ischemica ed aumenta il grado di sopravvivenza degli animali. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’effetto proinfiammatorio delle proteasi seriniche associate al danno tissutale dipende dall’attivazione del recettore PAR1 e PAR2 Lo sviluppo di terapie complementari in grado di bloccare selettivamente l’attività del recettore istaminico H4 e di inibire l’attività delle proteasi seriniche può rappresentare un ulteriore approccio terapeutico nella prevenzione dal danno locale e sistemico determinato da una condizione di ischemia e riperfusione intestinale. Fri, 31 Dec 2010 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1588 2010-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1587 Title: SIDS, SIUD e ALTE: differente espressione fenotipica di una base eziopatogenica comune? Authors: Filonzi, Laura Abstract: L’attività di ricerca svolta nell’ambito del corso di dottorato si è focalizzata su tre diverse sindromi con possibile base eziopatogenica comune: la morte improvvisa del lattante (SIDS), le morti intrauterine di feti a termine (SIUD) e le ALTE (Apparent Life Threatening Event), cioè neonati che vanno incontro a crisi apparentemente minacciose per la vita, da tempo considerate un evento premonitore della SIDS. Nonostante a tutt’oggi queste tre sindromi siano ad eziopatogenesi sconosciuta, alcuni studi di genetica molecolare hanno portato un importante contributo ad una migliore comprensione della sola morte improvvisa del lattante, mettendo in evidenza il coinvolgimento di mutazioni geniche e di polimorfismi del DNA in questa sindrome. Alcuni studi avviati nei primi anni 2000 hanno dimostrato il coinvolgimento di geni responsabili di cardiopatie su base aritmogena in età perinatale, di geni coinvolti nello sviluppo del sistema nervoso autonomo, di polimorfismi di mediatori della risposta immunitaria, nonché di sequenze regolatrici il metabolismo di neurotrasmettitori. A fronte di queste scoperte i risultati sono stati spesso contraddittori tra i diversi ricercatori, con considerazioni finali talvolta dubitative circa una possibile componente genetica della sindrome e al ruolo dei fattori genetici rispetto a quelli ambientali. Che possa esistere una componente genetica in alcune forme di morte in culla emerge tuttavia chiaramente da studi che valutano la ricorrenza della patologia in ambito familiare. Per quanto concerne invece SIUD ed ALTE, non esistono in letteratura pubblicazioni scientifiche sulle loro basi molecolari in grado di chiarire i meccanismi patogenetici delle due sindromi. Il mio lavoro di tesi è stato orientato verso la ricerca delle relazioni potenzialmente esistenti tra i geni codificanti per proteine che regolano la trasmissione ed il metabolismo di alcuni neurotrasmettitori e le tre sindromi peri/post neonatali descritte, partendo dall’assunto comune formulato da alcuni autori circa un coinvolgimento del SNC e SNP. Sono quindi stati presi in esame 20 casi SIDS e 5 casi SIUD accertati mediante rilievo autoptico in Lombardia ed in Emilia Romagna, 76 casi ALTE (48 ALTE idiopatiche e 28 ALTE con causa) e 150 controlli sani. I geni analizzati sono tutti codificanti per proteine coinvolte nel metabolismo di serotonina, dopamina e GABA e sono: SLC6A4 (5HTT), MAOA, TPH2, GABA(B)R1, SLC6A3 (DAT). I risultati più significativi in ambito SIDS/SIUD riguardano sicuramente il trasportatore della serotonina e in particolar modo il polimorfismo di lunghezza presente a livello della regione promotrice del gene 5HTT (5HTTLPR). L’alta frequenza del genotipo L/L e dell’allele L nei casi SIDS/SIUD oggetto di questo lavoro è risultata in accordo con quanto già osservato da Weese-Mayer et al., (2003) negli Stati Uniti e da Narita et al. (2001) nella popolazione Giapponese. E’ stato inoltre possibile dimostrare la netta prevalenza del genotipo L/L nei casi di IALTE; per quanto riguarda le ALTE con causa, la frequenza del genotipo L/L è risultata essere perfettamente sovrapponibile a quella dei controlli. La discordanza delle frequenze percentuali del genotipo L/L tra i casi di ALTE non-idiopatica e le IALTE potrebbe indicare una differenza nei meccanismi eziopatogenici tra le IALTE e le ALTE non idiopatiche. Allo stesso modo, la frequenza dell’allele L, nelle ALTE idiopatiche, è risultata essere il doppio rispetto a quella dei controlli e perfettamente coincidente con quella di SIDS e SIUD. Queste osservazioni permettono di fare un parallelismo tra le ALTE idiopatiche e la SIDS; la componente genetica comune potrebbe far supporre l’identità tra le due sindromi. I risultati ottenuti per il trasportatore della serotonina, sono di grande interesse in relazione al ruolo che questo neurotrasmettitore riveste nei meccanismi di regolazione del ciclo sonno/veglia. In un periodo post natale di completamento del processo maturativo del SNC e SNA, un deficit di arousal, in concomitanza di eventi quali stati di acidosi, apnee prolungate, ipertermia, tachicardia, ecc. che richiedono un risveglio immediato, potrebbe risultare letale. Thu, 31 Mar 2011 22:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1587 2011-03-31T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1436 Title: Acidi grassi polinsaturi omega 3: modulazione del metabolismo del colesterolo Authors: Degirolamo, Chiara Abstract: Le malattie cardiovascolari sono la prima causa di mortalità nel mondo ed elevati livelli plasmatici di colesterolo sono uno dei più importanti fattori di rischio cardiovascolare. Studi epidemiologici e trials clinici hanno dimostrato che cambiamenti nello stile di vita, in primis la dieta, possono contribuire positivamente alla prevenzione cardiovascolare. Le proprietà cardioprotettive degli acidi grassi omega 3, acidi eicosapentenoico e docosaesaenoico (EPA e DHA), sono ampiamente documentate sia nell’uomo che in modelli animali. Le fonti principali di EPA e DHA sono il pesce e l’olio di pesce; nei paesi industrializzati il consumo di pesce è tuttavia limitato e fonti alternative di EPA e DHA sono necessarie. L’acido alfa-linolenico (ALA) è il precursore metabolico di EPA e DHA ed è l’acido grasso omega 3 più abbondante nella dieta dei paesi industrializzati. Questo lavoro di tesi è stato mirato allo studio del potenziale ipocolesterolemico e ateroprotettivo dell’ALA in un modello murino di aterosclerosi. I nostri dati indicano che l'ALA è capace di limitare l’accumulo plasmatico ed epatico di colesterolo quando confrontato con acidi grassi monoinsaturi (acido oleico). L’ALA si accumula nei lipidi neutrali, quali colesterolo estere e trigliceridi, mentre il suo metabolita EPA nei fosfolipidi. Successivamente abbiamo valutato se il potenziale ipocolesterolemico dell’ALA e l’arricchimento dei fosfolipidi con EPA si traducessero in ateroprotezione. Diete ricche in ALA sono state confrontate con diete ricche in acido oleico e olio di pesce. L’ALA, pur arricchendo sia i lipidi plasmatici ed epatici con EPA e DHA, non ha alterato il metabolismo del colesterolo così efficacemente quanto l’EPA e il DHA provenienti dall’olio di pesce. In questo lavoro di ricerca abbiamo confrontato in modo diretto l’EPA e il DHA di origine esogena (olio di pesce) con quelli sintetizzati per via endogena dall’ALA e abbiamo dimostrato che non tutti gli acidi grassi omega 3 sono ugualmente protettivi in un modello murino di aterosclerosi. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1436 2009-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1426 Title: Cellule endoteliali e aterosclerosi:studi in vitro e in vivo Authors: Costa, Sara Abstract: In linea con consistenti evidenze sperimentali, e diversi studi clinici, l’attuale visione dell’aterosclerosi pone l’accento sull’importante ruolo dell’endotelio, nel complesso meccanismo che porta alla formazione e alla progressione della placca aterosclerotica. L’isolamento, la propagazione e lo studio in vitro delle cellule endoteliali (EC) rappresenta un valido metodo per esplorare il ruolo fisiologico e patologico dell’endotelio vascolare. Nella prima parte dello studio abbiamo valutato l’abilità della Manidipina, calcio antagonista diidropiridinico di terza generazione, nell’inibire la secrezione di IL-6 e IL-8 da cellule endoteliali umane isolate da cordone ombelicale (HUVEC), in seguito a diversi stimoli pro-infiammatori. I meccanismi attraverso i quali la Manidipina manifesta effetti antiinfiammatori è indipendente dall’effetto sui canali del calcio, e quindi sulla pressione arteriosa; sulla base di con quanto osservato con altri calcio antagonisti, questo può essere correlato alla natura lipofila e alla capacità antiossidante di questa molecola. Diversi studi mostrano il ruolo pro-aterogeno delle HDL (high density lipoprotein) e del loro recettore fisiologico SR-BI. Indipendentemente dall’effetto sul profilo lipidico sembra che questo sia correlato al loro azione sulla disfunzione endoteliale. Nella ricerca sperimentale scaturisce l’esigenza di isolare le cellule endoteliali, e poter determinare l’espressione dei geni; questo per valutare in vivo la risposta di tali cellule in seguito al trattamento con diversi stimoli pro o anti infiammatori o in seguito al trattamento con farmaci. Lo scopo della ricerca, alla quale ho preso parte presso Hôpital de la Pitié, Paris, è stato quello di mettere a punto un protocollo per isolare le cellule endoteliali dall’ aorta di topo e valutarne in seguito l’espressione genica. Per la validazione abbiamo applicato il nostro metodo a topi iniettati con LPS e condotto un esperimento preliminare su un nuovo modello animale; esso è stato creato per investigare lo specifico contributo di SR-BI, espresso nelle cellule endoteliali, nel processo aterosclkkerotico e nell’infiammazione vascolare indotta da stimoli infiammatori e pro-aterogeni, quali le endotossine e l’ipercolesterolemia.; The invitro isolation, propagation and study of endothelial cells (EC) is an invaluable means by witch the function of the vascular endothelium in physiology and pathophysiology can be explored. Atherosclerosis is an infiammatory disease of the arterial wall, where both cellular and humoral immunity mechanisms are involved. Vascular endothelial dysfunction and lipoprotein retention into the arterial intima have been reported as the earliest events in the atherogenesis, promoting cytokines and chemokines release. In the first parte of this study we evaluated the antinflammatory activity of Manidipine, a third generation dyhidropyridine calcium antagonists (DHP-CA), in modulating the release of IL-6 and IL-8 from human endothelial cells, in response to different pro-inflammatory signals. The mechanism by which Manidipine exert its antinflammatory effect is not related to its blocking activity on calcium channels and, in analogy with what observed for other DHP-CA, may be related to the high lipophilicity and to the antioxidant activity of this compound. The data emerging on vascular EC function in gene-targeted mice has highlighted the need for reliable methods of isolation of murine EC and evaluate the endothelial response to different inflammatory stimuli. In the second part of the study we set up a new procedure to isolate endothelial cells from mouse aorta in order to evaluate a gene expression profile. To validate our protocol we tested it in LPS treated mice, and we performed preliminary experiment in a new mouse model, created for to elucidated the specific impact of the deletion of SR-BI on the endothelium response to various inflammatory and pro-atherogenic stimuli which include endotoxins and hypercholesterolemia. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1426 2009-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1425 Title: Investigation into the µ opioid receptor role in an experimental model of mesenteric ischemia/reperfusion. Authors: Saccani, Francesca Abstract: ABSTRACT Intestinal ischemia is a clinical gastrointestinal emergency associated with high morbidity and mortality. Aim of this study was to investigate whether activation of µ opioid receptors (µORs) protects from the injury induced by intestinal ischemia and reperfusion. Ischemia was induced by occlusion of the superior mesenteric artery (45 min) and followed by reperfusion (5hours) (I/R). Sham Operated (SO) and normal (N) mice served as controls. Each group received subcutaneously: (1) saline solution; (2) the µOR selective agonist, [D-Ala2,N-Me-Phe4,Gly5-ol]-enkephalin (DAMGO) (0.01 mg kg−1); (3) DAMGO and the selective µOR antagonist [H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2] (CTAP) (0.1 mg kg−1) or (4) CTAP alone. Compared to SO, I/R induced intestinal inflammation as indicated by the histological damage and the significant increase in myeloperoxidase (MPO) activity (index of tissue neutrophil accumulation). Treatment with DAMGO significantly reduced tissue damage and MPO activity in I/R and these effects were reversed by CTAP. Significant increase in levels of the inflammatory cytokine TNF-a and IL-10 mRNA was detected in I/R mice compared to SO. DAMGO significantly reduced TNF-a mRNA levels in I/R, effect that was abolished by CTAP, but did not modify IL-10 mRNA levels. µOR mRNA levels were comparable in I/R, SO and N mice. There was a significant delay in gastrointestinal transit in both I/R and SO compared to N mice, which was not affected by DAMGO administration. In summary, this investigation shows that exogenous activation of µORs plays a protective role in our experimental model of mesenteric I/R in mice. Indeed, µOR activation is able to reduce the intestinal damage induced by I/R, through a mechanism that appears to be in part mediated by TNF-a. Thu, 31 Dec 2009 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/1889/1425 2009-12-31T23:00:00Z