http://hdl.handle.net/1889/656 2013-05-18T22:09:26Z http://hdl.handle.net/1889/1834 Title: The protective role of antioxidants and the aldo-keto reductase AKR7A2 against toxic aldehydes in cell lines Authors: Ferrari, Michele Abstract: Aldehydes and ketones are widely distributed in nature and can be very reactive, causing damage to DNA, proteins and lipids within the cell. A number of antioxidant molecules are able to react with reactive molecules to minimize their damaging effects. The human body also has a series of enzyme systems for protecting itself against reactive aldehydes and ketones including alcohol dehydrogenases (ADH), aldehyde reductases (AKR) and aldehyde dehydrogenases (ALDH). Some antioxidants are also able to increase the expression of these protective enzymes thereby leading to enhanced protection. In this thesis, intrinsic and extrinsic mechanisms of protection against the toxicity of aldehydes were investigated. In the first part of this thesis, the toxicity of acetaldehyde to HepG2 human hepatoma and 1321N1 astrocytoma cells was investigated as a model for liver and brain cells. Acetaldehyde is a toxic metabolite of ethanol, and is thought to be a major determinant in alcohol toxicity. Acetaldehyde did not cause significant toxicity to 1321N1 or HepG2 at concentrations below 1 mM, but was toxic to 1321N1 cells at higher concentrations. However, acetaldehyde was able to cause an increase in activated caspase-ca3 and DNA fragmentation at concentrations between 5 and 25 µM in HepG2 cells, indicating an induction of apoptosis. Three antioxidants (vanillin, gallic acid and resveratrol) were investigated for their capacity to protect cells against the toxicity of reactive aldehydes. Methylglyoxal and acrolein are products of the peroxidation of lipids and arise during exposure of cells to oxidants. The antioxidants vanillin and gallic acid are found in whisky in the non-volatile fraction and resveratrol is found in red wine. The antioxidants were not able to protect the cells against the aldehydes at the concentrations tested, but did increase cell viability. It appears that vanillin can inhibit ADH as well as ALDH activity by binding to the enzymes without altering their expression levels. To investigate whether the AKR enzymes are involved in protection against aldehyde toxicity, human AKR7A2 and the mouse AKR7A5 were purified and characterized with different substrates including muconaldehyde, crotonaldehyde, acetaldehyde and methylglyoxal. Both AKR7A2 and AKR7A5 enzymes showed a high Km and low turnover number for all three of the aldehydes tested, indicating relatively low specificity. To better understand the role of AKR7A2, the gene encoding the enzyme was transiently transfected into 1321N1 and HepG2 cell lines and exposed to crotonaldehyde, muconaldehyde and methylglyoxal. However, AKR7A2 was not able to protect cells against aldehyde toxicity, and, in some cases, its overexpression increased toxicity. Only when crotonaldehyde was tested at a relatively high concentration the transfected cells did show increased viability compared to the control, suggesting that the enzyme AKR7A2 could be involved in crotonaldehyde detoxification. Transfected HepG2 cells showed an increase in viability compared to the non-transfected control cells, at almost all the tested concentrations. Taken together these results show that AKR7A2 is able to protect HepG2 liver cells against the aldehydes, but is not able to protect 1321N1 brain cells. 2012-03-15T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1827 Title: Identificazione funzionale su scala genomica degli attivatori trascrizionali di due funghi filamentosi simbiotici Authors: Levati, Elisabetta Abstract: Nel mio lavoro di dottorato, una parte del quale rientra in un progetto di ricerca internazionale (“TuberGenomics”) di cui fa parte il laboratorio in cui ho lavorato, mi sono occupata dell’analisi degli attivatori trascrizionali codificati dal genoma di due funghi filamentosi simbiotici Tuber melanosporum, un ascomicete filamentoso ipogeo produttore di corpi fruttiferi pregiati (“tartufi”), e di Laccaria bicolor, un basidiomicete. Questi organismi sono gli unici funghi simbiotici il cui genoma è stato sequenziato. Inoltre mi sono occupata anche dell’analisi degli attivatori della trascrizione del pioppo Populus trichocarpa, la pianta con cui Laccaria instaura la simbiosi. Lo scopo principale della ricerca è stata l’identificazione mediante approcci informatici di tutti i potenziali fattori di trascrizione presenti nel genoma di questi funghi e l’isolamento di alcuni attivatori della trascrizione mediante screening funzionale nel lievito Saccharomyces cerevisiae. L’analisi in silico si è basata sulla ricerca di omologia con fattori di trascrizione già noti in altri organismi e sulla catalogazione in famiglie degli stessi incentrata sui domini di legame al DNA. In T. melanosporum sono stati identificati mediante analisi in silico 201 fattori di trascrizione (TF), di cui 102 ortologhi a TF a funzione nota, 57 omologhi a fattori di trascrizione a funzione sconosciuta e 42 unici di Tuber mentre in L. bicolor sono stati identificati 215 fattori di trascrizione. Per validare funzionalmente alcuni di questi TF e per scoprire nuovi attivatori della trascrizione si è eseguito il Transcriptional activator trap (TAT) uno screening genomico-funzionale, basato su una variante del sistema del doppio ibrido nel lievito Saccharomyces cerevisiae, che è stato effettuato su librerie a cDNA corrispondenti alle tre fasi del ciclo vitale di Tuber melanosporum e Laccaria bicolor e alla radice del pioppo. Le ORF contenute nelle genoteche a cDNA sono state fuse al dominio di legame al DNA (DBD) di Gal4 mediante l’utilizzo del sistema Gateway® e usate per la trasformazione di un ceppo di lievito contenente tre geni reporter (HIS3, URA3 e LacZ) posti sotto il controllo di una Upstream Activating Sequence (UASGal) riconosciuta dall’attivatore Gal4. Le proteine di fusione Gal4-DBD-Tuber ORF vengono localizzate nel nucleo (grazie ad un NLS presente all’interno del DBD di Gal4) e se la componente di Tuber è in grado di attivare la trascrizione dei geni reporter vengono classificate come auto-attivatori. Per quanto riguarda Tuber in totale sono stati sequenziati gli inserti di 438 cloni risultati positivi al saggio (160 da micelio, 126 da corpo fruttifero, 152 da ectomicorriza) corrispondenti a 141 sequenze uniche. Tra queste sequenze ne riconosciamo 100 di fungo mentre le altre 41, come atteso, appartengono a pianta. Tra le sequenze di fungo 44 possiedono un DBD (DNA binding domain) e quindi sono state catalogate come putativi fattori di trascrizione, questo risultato ci ha permesso di validare un quarto dei fattori di trascrizione predetti in silico. Le altre invece non posseggono un DBD riconoscibile e vengono classificate come unconventional activators (UAs) se hanno una localizzazione nucleare o mista (nucleo/citoplasma) con un documentato ruolo nella attivazione della trascrizione (20 proteine identificate) oppure putative unconventional activators (PUAs) se non posseggono un ruolo documentato nella trascrizione (43 sequenze). Tra le 41 sequenze di pianta 22 posseggono un DBD e tra queste ritroviamo fattori di trascrizione coinvolti nell’interazione pianta-patogeno, 1 sequenza appartiene alla categoria UAs mentre le restanti 18 sono PUAs. Per Laccaria sono stati sequenziati 595 cloni di cui 408 di fungo e 187 di pianta che sono state organizzate in 83 contigs e 137 singletons, per un totale di 220 sequenze uniche di cui 80 di Laccaria e 140 di pianta. Delle 80 sequenze uniche di Laccaria, 19 sono rappresentate da fattori trascrizionali poiché contengono un DNA binding domain mentre le restanti 61 sequenze positive mancano di DBD noto. Tra queste si ritrovano 14 sequenze che vengono definite “Nuclear protein and Unconventional activators” (UAs) simili a geni che esprimono proteine con localizzazione nucleare o mista nucleare/citoplasmatica per le quali un ruolo diretto o indiretto nella regolazione della trascrizione è stato precedentemente dimostrato. Tra le altre sequenze prive di un DBD 31 ricadono nella categoria “Putative unconventional activators” (PUAs) poiché in letteratura non è noto un loro ruolo nella trascrizione. Le restanti 16 sequenze fanno parte delle proteine secrete tra cui 5 possiedono un dominio di localizzazione nucleare. Tra le 140 sequenze di pianta si isolano 61 proteine contenenti un DBD e 79 proteine prive di un DBD noto. All’interno di questa categoria ritroviamo 26 UAs e 53PUAs. Alcune delle sequenze così isolate possono essere dei falsi positivi dovuti alla presenza, all’interno del vettore utilizzato, del segnale di localizzazione NLS di Gal4. Infatti, a seguito della forzata localizzazione nucleare della proteina di fusione, possono venire identificate come attivatori trascrizionali anche proteine che, prive di un NLS, svolgono normalmente ruoli extra-nucleari. È dunque importante stabilire se le proteine per le quali non è mai stata riportata una azione/localizzazione nucleare e le proteine a funzione ignota sono effettivamente dotate di un NLS autonomo tale da giustificarne un possibile ruolo come attivatori trascrizionali. A tale scopo ho utilizzato il saggio di Nuclear transportation trap (NTT) basato sull’espressione di una proteina di fusione tra un fattore di trascrizione artificiale privo del segnale di localizzazione nucleare e la proteina di interesse. Se quest’ultima possiede un NLS funzionale il prodotto di fusione entra nel nucleo e attiva la trascrizione dei geni reporter LacZ e HIS3 posti a valle di un sito operatore riconosciuto dal fattore di trascrizione artificiale. Dopo una prima fase di messa a punto, ho effettuato il saggio NTT su un totale di 15 sequenze appartenenti a Tuber e su due proteine di Laccaria. Tra le proteine di Tuber sono state saggiate sequenze che codificano per sei enzimi del metabolismo che potrebbero rappresentare buoni candidati per l’isolamento di nuove moonlighting protein, due chinasi, Maf1 e Ste50, la calcineurina, la perossina 20, l’actina, la proteina Ltv1 e due proteine uniche di Tuber a funzione sconosciuta. Come controllo positivo si è utilizzato il fattore di trascrizione MetR. Di queste proteine 8 risultano avere un segnale di localizzazione: MetR, una proteina unica di Tuber, Maf1, Ltv1, Pex20, e 3 enzimi metabolici. Per quanto riguarda le proteine secrete di Laccaria non si sono ottenuti risultati positivi. E’ stata quindi messa a punto una efficace strategia per l’isolamento di cDNA codificanti per attivatori trascrizionali. Tale strategia ci ha permesso di validare una parte dell’annotazione in silico, ma ha anche portato alla identificazione funzionale di proteine ipotetiche e alla scoperta di nuovi fattori di trascrizione. Dal momento che, almeno per il tartufo, sono già stati validati sperimentalmente alcuni TF maggiormente espressi in ectomicorriza o corpo fruttifero unici di Tuber, è di enorme interesse identificare i geni su cui agiscono, e quindi il loro sito di legame al DNA. A questo scopo, mi sono occupata della messa a punto della metodica di bacterial one hybrid (B1H) che consente di determinare la specificità di legame ad una sequenza di DNA da parte di un fattore di trascrizione di interesse. Questo sistema sfrutta tre componenti: un vettore esca che consente l’espressione di un fattore di trascrizione fuso alla subunità omega della RNA polimerasi batterica, un vettore contenente una library di oligonucleotidi di 20bp a sequenza casuale posti a monte dei geni reporter URA3 e HIS3 (espressi nel medesimo cistrone) e un appropriato ceppo batterico in cui i geni omologhi a URA3 e HIS3 sono stati deleti. Se il fattore di trascrizione espresso lega una sequenza della library è in grado di attivare l’espressione del gene reporter HIS3 e quindi conferisce la capacità ai batteri di crescere in piastre contenenti terreno selettivo addizionato di 3-amino-triazolo (3AT). Nella prima parte della messa a punto del metodo mi sono occupata della progettazione, della costruzione della libreria e della sua propagazione in batterio. Successivamente è stata eseguita la ripulitura della library per eliminare quei cloni che attivano l’espressione dei geni reporter in modo indipendente dal fattore di trascrizione (esca) mediante selezione negativa su terreno selettivo contenente acido 5-fluoro-orotico (5-FOA), il 5-FOA viene convertito in un composto tossico per le cellule se il gene URA3 è espresso. La selezione del motivo di legame al DNA viene eseguita trasformando il ceppo batterico, in cui è stato precedentemente clonato il fattore di trascrizione, con la library ripulita ed eseguendo una selezione positiva dei cloni che attivano l’espressione del gene reporter HIS3 su terreno selettivo contenente 3AT. Una volta ottenuta la sequenza degli oligonucleotidi da 20bp isolati si utilizzano programmi bioinformatici per identificare il motivo di DNA a cui si lega il TF. Successivamente è necessaria una ricerca di questo motivo sul genoma dell’organismo per determinare i geni che vengono regolati dal TF in esame. La strategia è stata messa a punto utilizzando un controllo positivo che ci è stato fornito con il materiale del B1H e si è eseguito lo studio di fattori di trascrizione e di una proteina appartenente alla categoria PUA la fosfoadenosina fosfosolfato reduttasi di T. melanosporum. Tra i fattori di trascrizione presi in esame sono presenti due TF coinvolti nel metabolismo dell’azoto TmelNirA-1e TmelNirA2 e TF unici di Tuber, maggiormente espressi in ectomicorriza o corpo fruttifero, che non hanno una funzione nota. A seguito di tali esperimenti è stata possibile l’identificazione di un motivo di legame al DNA solamente per il fattore di trascrizione NirA2 e per un fattore unico di Tuber che risulta up-regolato nell’ectomicorriza. La parte del lavoro riguardante l’analisi in silico e lo screening mediante Transcriptional activator trap dei fattori di trascrizione codificati dal genoma di T. melanosporum è già stata pubblicata nell’articolo “Genome-wide search and functional identification of transcription factors in the mycorrhizal fungus Tuber melanosporum” B.Montanini, E. Levati et al; New Phytologist (2010) 2012-03-15T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1826 Title: Bovine herpesvirus 4 Immediate Early II gene is essential and can be duplicated Authors: Franceschi, Valentina Abstract: Bovine herpesvirus 4 (BoHV-4) is a virus with a worldwide distribution in cattle population that has been isolated from a lot of different tissues and samples from animal with various clinical manifestations, ranging from conjunctivitis, ocular discharge and genital diseases as post-partum metritis or abortion, but even in apparently healthy animal. Even if a clear correlation between BoHV-4 and any pathologies has never been demonstrated; BoHV-4 is most consistently associated with metritis, a very common postpartum disease of the uterus, in which the role of BoHV-4 as a secondary pathogen is well documented. BoHV-4 has a well known tropism for endometrial stromal and epithelial cells, in which causes non-apoptotic cell death and de novo virus production associated with an increased prostaglandin-endoperoxide synthase 2 protein, cyclo-ossigenase 2 (COX2) and prostaglandin E2 production and secretion from stromal cell. BoHV-4 activation and replication in the bovine endometrium is associated with the early transactivation of the BoHV-4 IE2 gene promoter from endometrial cells. BoHV-4 IE2 gene promoter transactivation and viral replication were associated also with extracellular stimuli belonging to the intrauterine microenvironment such as E. coli LPS and PGE. A model that fits well endometrial BoHV-4 disease is described in literature, involving a vicious circle comprising of bacterial endometritis leading to secretion of PGE, then PGE and LPS stimulating virus replication, which causes further endometrial tissue damage and inflammation. The existence of a virus patho-biotype causing uterine disease appears possible; virus strain adaptation to an organ, tissue or cell type is infact a very important issue for the study of pathology, even because the function of most of the viral genes remains still unknown. In this study a BoHV-4 strain was isolated from the uterus of a persistently infected cow affected with non-responsive post-partum metritis and designated BoHV-4-U. After the characterization this uterine strain was cloned as a bacterial artificial chromosome (BAC) to easily manipulate and study the viral genome. The feasibility of using BoHV-4-U for mutagenesis was demonstrated using the BAC recombineering system, that allows to study single or multiple gene disruptions, opening the way to the clarification of the interactions between BoHV-4 infection and the host endometrial cells. After the generation of the BAC-BoHV-4-U the first gene we decided to investigate was the ORF50/Rta gene, that has been shown to be an essential gene for DNA replication and latency reactivation in many gammaherpesviruses. Although the BoHV-4 ORF50/Rta homolog, immediate early gene 2 (IE2), has been shown to activate several BoHV-4 early and late promoters in co-transfection assays, there is no direct proof of its real indispensability for progression of the virus to the lytic replication cycle in the context of the viral genome. Through different strategies the ORF50 gene was interrupted generating before some mutants, replication defective BoHV-4-V.test /IE2 mutants, as a control viruses, and then some BoHV-4-U/IE2 mutants. The BoHV-4-V.test/IE2 mutants was efficiently rescued, with respect to the production of infectious virus and DNA replication, upon the expression of the BoHV-4 ORF50/Rta protein in trans by different complementing cell lines; the BoHV-4-U/IE2 mutants surprisingly were all able to growth, even in non-complementing cell lines. The generation of a suitable probe led to discover that the IE2 gene is duplicated in the genome of BoHV-4-U. These data demonstrated that in BoHV-4, too, ORF50/Rta is the master replication switch gene and, that can be duplicated in some strains, as in our uterine strain. The deletion of the second gene copy of BoHV-4-U Rta unable the virus the capacity to replicate, and this inability was completely complemented by the in trans expression of ORF50/Rta. The generation of this completely replication un-competent virus maybe will provide a new powerful tool for recombinant vaccine production, even in respect to the rescue of the virus through the expression, under a strictly inducible promoter, of the Rta protein. 2012-03-15T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1825 Title: STUDIO DEL PROCESSO DI MATURAZIONE ED ATTIVAZIONE DI FOSFOLIPASI A2 FUNGINE Authors: Corsini, Romina Abstract: TbSP1 (Tuber borchii secreted protein 1) è una fosfolipasi che si accumula nello strato interno della parete cellulare e nello spazio extracellulare in miceli, corpi fruttiferi e micorrize del fungo simbiotico T. borchii. Un’analisi dei livelli di mRNA di TbSP1 in funghi cresciuti in vivo in differenti condizioni nutrizionali ha evidenziato una regolazione in risposta alla disponibilità di nutrienti. In particolare, terreni carenti di carbonio o di azoto, inducono un significativo aumento nell’espressione di TbSP1. E’ stato precedentemente dimostrato che la proteina è in grado di attivarsi mediante auto rimozione della porzione N-terminale sia in vitro che in vivo. Il meccanismo del processo di digestione di TbSP1 è di tipo intermolecolare ed endoproteasico. Il sito proteasico è localizzato sul frammento di 14.5 kDa ed è distinto dal sito fosfolipasico. Nel presente lavoro di tesi viene descritta la caratterizzazione biochimica di TbSP1 con la determinazione dei parametri cinetici della reazione fosfolipasica così come delle costanti di affinità per il calcio di TbSP1. E’ stata inoltre analizzata l’importanza della presenza dello ione calcio in relazione alle due attività di TbSP1 e sono stati condotti esperimenti al fine di identificare i residui responsabili dell’attività proteasica. Inoltre, TbSP1 viene confrontata con altre fosfolipasi A2 fungine. In particolare è stata indagata la possibilità che due proteine da T. melanosporum e N. crassa, omologhe a TbSP1, abbiano lo stesso meccanismo di maturazione ed attivazione. Infine, viene analizzata l’attività fosfolipasica e l’eventuale capacità di digestione in trans di una forma stabile di TbSP1 da parte di alcune tra le principali PLA2 descritte in letteratura. 2012-03-15T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1697 Title: A CC-NB-LRR gene confers leaf stripe resistance at the Rdg2a locus in barley Authors: Biselli, Chiara Abstract: Barley leaf stripe, caused by the seed-transmitted hemi-biotrophic fungus Pyrenophora graminea, is a barley disease particularly acute in Nordic countries, during spring sowing, and in the Mediterranean’s winter barley districts where causes severe yield losses. To date, only two P. graminea race-specific resistance genes are known: Rdg1a, identified in cultivar Vada, and Rdg2a, identified in cv. Thibaut. Rdg2a confers immunity to at least three different P. graminea monoconidian isolates, including the most widespread and virulent Italian isolate Dg2, but it is overcome by Dg5. The aim of the present work was to isolate this gene, characterize the Rdg2a locus and its evolution and mine the bases of Rdg2a-mediated resistance. In a previous analysis the map-based cloning and the sequencing of the Rdg2a locus were carried out. Three homolog R genes encoding CC-NB-LRR proteins, that represent the majior class of resistance proteins, were identified at the locus and were named as Nbs1-Rdg2a, Nbs2-Rdg2a and Nbs3-Rdg2a (Bulgarelli et al., 2010). To determine which of the three genes is the Rdg2a gene, we started the research investigating their structure. RACE analyses showed that for the third candidate (Nbs3-Rdg2a) alternative splicing processes determine the synthesis of severly truncated and probably non-functional proteins. This allowed us to excluded Nbs3- Rdg2a from acting in resistance to isolate Dg2. By means RT-PCRs on a pair of Near Isogenic Lines (NIL) that differ only for alleles at the Rdg2a locus (susceptible cv. Mirco and its resistant NIL, NIL3876), we demonstrated that both Nbs1-Rdg2a and Nbs2-Rdg2a are transcribed in embryos (where the resistance takes place) and leaf tissues of the resistant line, but they are not expressed in the susceptible nearisogenic phenotype. Sequencing of the Mirco alleles revealed rearrangements in the putative promoter regions: two insertions, one next to a putative TATA-box element and the other, carrying terminal inverted repeats, in the 5’ UTR, for Nbs1-rdg2a, and a deletion just at the level of a MITE-like element, present in Thibaut Nbs2-Rdg2a, for Nbs2-rdg2a. It is likely that these changes represent the cause of the lacking of expression of these genes in the susceptible genotype. Moreover, qRT-PCRs showed that Nbs1-Rdg2a transcription was un-responsive to P. graminea infection, while Nbs2-Rdg2a transcripts increased during the first stages of infection. However, Nbs2-Rdg2a mRNA abundance was significantly lower than that of Nbs1-Rdg2a. To define which gene is the Rdg2a gene, a complementation assay was conducted. Susceptible cv. Golden Promise was transformed by agoinfiltration with each gene independently, under the control of its native promoter. Interestingly, the rescue of Dg2-resistance was observed only when plants were transformed with Nbs1-Rdg2a (90-100% of resistance), suggesting that this gene is Rdg2a. Comparing the sequences of the three genes at the Rdg2a locus, we found that similarly to other R genes, Rdg2a underwent to diversifying selection, according to a model in which resistance genes co-evolves with pathogen effector(s) gene(s). The fact that the Rdg2a locus contains a gene cluster of highly similar sequences has most likely contributed to significative rearrangements during evolution, probably derived from unequal crossovers resulting in sequence exchange between paralogs and, possibly, in the generation of recombinant genes, as well as to expansion/contraction of gene copy number. Regarding this last case, we have also characterized the rdg2a locus of the susceptible cv. Morex. Morex rdg2a locus carries two deletions and the rdg2a allele might derived from an un-equal crossingover between Rdg2a and Nbs2-Rdg2a ancestors that led to a reduction of the number of the gene family members. Most resistance proteins function through inducing a Programmed Cell Death (PCD) that lead to a Hypersensitive Response (HR) at the level of the infected cells. Histological analyses using the TUNEL method did not reveal any significative difference in PCD between infected embryos of resistant and susceptible varieties and the number of cells undergoing PCD was transcurable. These finding let us to conclude that the Rdg2a-mediated resistance does not involve HR but it is most likely based on the strengthening of physical and chemical barriers in the cell walls and intercellular spaces of the embryo tissues. In conclusion, we identified, cloned and characterized the first resistance gene active against a seed-borne disease; importantly, the gene belongs to the poorly represented class of R genes which does not trigger a hypersensitive responce. 2010-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1600 Title: Regolazione epigenetica dell'espressione di clusterina in linee cellulari umane di cancro prostatico Authors: Coletta, Mariangela Abstract: La Clusterina (CLU) è un proteina ubiquitaria, presente nella maggior parte dei fluidi biologici, che è implicata in quasi tutti i processi fisiologici fondamentali dell’organismo umano e nello sviluppo di diverse malattie come il cancro e l’Alzheimer. Il gene umano CLU è costituito da 9 esoni e si colloca nella regione centrale del braccio corto del cromosoma 8 (8p21-p12), zona frequentemente deleta nel cancro della prostata. Un recente aggiornamento in GenBank ha evidenziato l’esistenza di due varianti trascrizionali della CLU umana (NM_001831 Isoforma 1; NM_203339.1 Isoforma 2), presenti esclusivamente nei primati, lche hanno sostituito la precedente sequenza M64722.1. Queste isoforme condividono la sequenza nucleotidica dall’esone 2 all’esone 9 e la regione 3’ non tradotta, ma possiedono un esone 1 diverso e specifico. Inoltre nel 2003 è stato descritto un ulteriore messaggero nel quale, in seguito ad un fenomeno di splicing alternativo, parte dell’esone 1 di quella che attualmente è Isoforma 1 sarebbe direttamente legato all’esone 3. Attualmente in letteratura sono descritte differenti forme proteiche di Clusterina caratterizzate da funzioni e localizzazioni cellulari differenti: la forma presecretoria (psCLU), la forma secreta (sCLU), la forma nucleare (nCLU). La traduzione a partire dall’AUG nell'esone 2, presente in entrambe le isoforme, genera un precursore citoplasmatico di circa 60 kDa (psCLU) che una volta processato porta alla produzione della proteina matura destinata alla secrezione s(CLU). sCLU si presenta come un eterodimero aβ glicosilato di circa 75-80 kDa e si comporta come un chaperone molecolare ATP indipendente. La traduzione a partire dal codone d’inizio presente nel terzo esone, anch’esso comune ed entrambe le isoforme, genera invece una forma a localizzazione nucleare (nCLU o forma troncata) con funzione proapoptotica del peso di 45-50 kDa. Ad oggi deve essere fatta ancora chiarezza sul processo che porta a partire da un unico gene alla trascrizione dei due differenti messaggeri e alla sintesi delle tre varianti proteiche. Inoltre, scarsi sono i dati sul loro possibile meccanismo specifico di azione. In questo lavoro di tesi è stata valutata la distribuzione delle due isoforme di CLU e la presenza del messagero alternativo proposto nel 2003 in diverse linee cellulari umane. Questa analisi non ha confermato eventi di splicing alternativo ma ha evidenziato una differente espressione delle due varianti trascrizionali di CLU: L’Isoforma 1 è costitutivamente espressa in tutte le linee analizzate, mentre l’Isoforma 2 risulta assente in tutte le linee tumorali prese in considerazione, apparendo quindi correlata in modo specifico agli eventi coinvolti nella trasformazione neoplastica. I dati emersi da questa primo studio ci hanno portato ad ipotizzare una regolazione differenziale dell’espressione di questi due trascritti che potrebbe derivare dalla presenza di regioni promotrici e di siti d’inizio trascrizione (TSS) differenti. Questa ipotesi coinvolgerebbe meccanismi di tipo epigenetico. Un’analisi “in silico” della regione genomica di CLU ha effettivamente rilevato la presenza di TSS e regioni promotrici differenti per le due isoforme ed ha inoltre individuato due isole CpG, potenzialmente oggetto di metilazione. In letteratura, sono riportati diversi lavori che propongono una regolazione di CLU per via epigenetica ma in nessuno di questi è stato preso in considerazione come questa possa eventualmente influire in modo differenziale sulla trascrizione delle due isoforme. Perciò si è proceduto trattando le linee cellulari di cancro prostatico PC3 e DU145 con tricostatina A (TSA), un inibitore delle istone deacetilasi (HDAC) di classe I e II e/o con 5-aza-2’deossicitidina (5AzadC), un inibitore delle DNA metiltransferasi (DNMT), al fine di valutare gli effetti da essi indotti sull’espressione di CLU. È così emerso che tali composti sono in grado di indurre in cellule tumorali prostatiche un rimodellamento della cromatina a livello delle regione promotrici di CLU che comporta: i) la riattivazione della trascrizione dell’Isoforma 2; ii) un incremento nella produzione e nella secrezione di sCLU; ii) la comparsa in DU145 di nCLU, che si localizza a livello nucleare inducendo queste cellule ad intraprendere il pathway di morte programmata per apoptosi. Nel complesso, i dati raccolti evidenziano che è presente una down-regolazione dell’espressione di CLU in cellule tumorali di prostata, particolarmente marcata a livello della trascrizione dell’Isoforma 2, che quale appare completamente repressa. I risultati ottenuti, visti nel loro insieme, portano ad ipotizzare che alla base di questo tipo di silenziamento genico vi siano meccanismi di regolazione epigenetica differenziali che agiscono probabilmente a livello di regioni genomiche diverse. 2011-03-22T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1599 Title: Biochemical characterization of human kynurenine aminotransferase II (hKAT II): a drug target for cognitive diseases Authors: Passera, Elisabetta Abstract: L’attività di ricerca svolta durante il corso di dottorato ha riguardato la caratterizzazione biochimica dell’enzima chinurenina aminotransferasi II di origine umana (hKAT II). hKAT II è un enzima piridossal 5’-fosfato (PLP)-dipendente, coinvolto nella via metabolica di degradazione del triptofano, nota come via della chinurenina, che porta alla formazione di NAD+. Alcuni intermedi di questa via metabolica sono neuroattivi e hanno recentemente assunto particolare interesse per il loro coinvolgimento nell’insorgenza di malattie neurodegenerative. Tra questi metaboliti neuroattivi vi è l’acido chinurenico (KYNA), che deriva dalla transaminazione irreversibile della L-chinurenina (KYN), catalizzata dall’enzima KAT. Fino ad oggi nel cervello dei mammiferi sono state identificate quattro isoforme di questo enzima, denominate KAT I-IV. KAT II è il principale enzima responsabile della sintesi di KYNA a livello cerebrale. KYNA agisce come antagonista di alcuni sottotipi di recettori glutamatergici e colinergici e diversi studi in vivo hanno dimostrato che alterazioni nella sintesi di KYNA sono in grado di influenzare le funzioni cognitive mediate da questi recettori. L’enzima KAT II è quindi un potenziale target farmaceutico per il trattamento di condizioni neuropatologiche caratterizzate da eccesso di KYNA e ipofunzionalità della neurotrasmissione colinergica e glutamatergica, quali schizofrenia e disturbi cognitivi. Nonostante queste importanti implicazioni biologiche e farmacologiche, sino ad oggi non è stata effettuata una estesa caratterizzazione biochimica di questo enzima. Inoltre, solo pochi composti sono attualmente disponibili come inibitori di hKAT II. I principali obiettivi del presente progetto di tesi sono stati i) l’ottimizzazione della resa di espressione mediante un innovativo sistema di crescita cellulare (EnBase BioSilta), ii) la caratterizzazione delle proprietà spettroscopiche di hKAT II in soluzione e allo stato cristallino, iii) la valutazione della propensione di hKAT II a catalizzare reazioni secondarie di b-eliminazione, iv) la messa a punto di nuovi saggi di attività di più facile utilizzo rispetto a quello attualmente riportato in letteratura e applicabili alla determinazione dei parametri catalitici, v) la determinazione dei meccanismi e delle costanti di legame di alcuni composti proposti essere inibitori specifici di hKAT II, e vi) lo sviluppo di un metodo rapido e semplice per lo screening su larga scala (high-throughput screening, HTS) di librerie di composti al fine di individuare nuove molecole in grado di inibire hKAT II. Gli studi condotti durante questo lavoro di tesi hanno permesso di ottenere una dettagliata caratterizzazione biochimica di hKAT II e di sviluppare nuovi saggi di attività applicabili allo sviluppo di farmaci per il trattamento terapeutico di schizofrenia ed altri disturbi cognitivi.; Kynurenine aminotransferase (KAT) is a pyridoxal 5’-phosphate dependent enzyme, which catalyzes the irreversible transamination of L-kynurenine (KYN) to produce kynurenic acid (KYNA). KYN is the central metabolite in the Kynurenine pathway (KP), the main tryptophan degradation pathway in most living organisms. The scientific interest in KP is unceasing because some of its enzymes and metabolites (kynurenines) mediate relevant physiological functions and associated pathological states of the immune and nervous systems. In particular, KYNA is a neuroinhibitory metabolite of the KP, acting as a broad-spectrum endogenous antagonist of ionotropic excitatory amino acid receptors and a7 nicotinic acetylcholine receptors, which are involved in cognitive functions like learning and memory. Since these antagonistic effects are seen at KYNA concentrations found in the mammalian brain, elevations in the brain KYNA has been hypothesized as an important factor contributing to the pathogenesis and progression of neurological or psychiatric diseases that are associated to cognitive impairment, including schizophrenia and Alzheimer’s disease. In human and rodent brains four proteins named KAT I, II, III and IV, have been reported to be involved in KYNA synthesis. In view of its biochemical properties, KAT II is the prevalent isoform responsible for KYN degradation in mammalian brain to give KYNA. Therefore, human KAT II is a potential drug target in the treatment of neurophatological conditions characterized by a glutamatergic and cholinergic hypofunction related to an excess of KYNA, like Schizophrenia and Alzheimer’s disease. Despite hKAT II is considered a potential regulatory target for maintaining physiological concentrations of KYNA, a thorough biochemical characterization of this enzyme is still missing. The principal aim of this study was a detailed assessment of hKAT II in regards its biochemical and functional characteristics. In particular, the activity of hKAT II towards the natural substrates kynurenine and a-aminoadipate, and the inhibitors (R)-2-amino-4-(4-(ethylsulfonyl)-4-oxobutanoic acid and sulfinic acid was investigated. Moreover, we determined for the first time the intrinsic b-lytic activity towards the substrate analog b-chloroalanine of hKAT II and a variant carrying the Y142F mutation, expected, on the basis of structural evaluations, to exhibit a decreased propensity for b-elimination, a side reaction common to transaminases. The biochemical investigation has allowed us to develop two efficient and rapid assays to screen hKAT II inhibitors: i) a continuous assay based on the absorbance of the natural substrate L-KYN, that allows fast measurement of enzyme activity and determination of inhibition mechanisms; and ii) a 96-well plate suited, end-point assay based on the coupling of hKAT II activity to two reporter reactions. These assays are of interest in the high-throughput screening for specific hKAT II inhibitors. The availability of these assays and a detailed spectroscopic analysis allowed to demonstrate that (R)-2-amino-4-(4-(ethylsulfonyl)-4-oxobutanoic acid and sulfinic acid, reported to be selective and potent rat KAT II inhibitors, are actually substrate for the human ortholog, rather than pure competitive inhibitors. As a part of the activities carried out during the thesis, we carried out attemps to increase the expression yield of soluble hKAT II. Recombinant expression of hKAT II was investigated by a novel culture method, called EnBase, or enzyme-based-substrate-delivery (BioSilta). EnBase (BioSilta) is an enhanced novel microbial culture system in which enzyme-based supply of glucose allows a glucose-limited growth, providing high cell densities and high recombinant protein yields. The avaibility of higher amounts of hKAT II, together with the tools developed for the high-throughput screening of hKAT II specific inhibitors will be useful in the development of novel drugs for cognitive dysfunction. 2011-02-28T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1598 Title: Identification à l'échelle génomique de génes transcrits par deux isoformes de l'ARN polymérase III humaine Authors: Pascali, Chiara Abstract: L’RNA polimerasi III (Pol III) trascrive piccoli RNA non codificanti, tra i quali l’RNA 5S, i tRNA, l’RNA U6, l’RNA 7SK e 7SL. La trascrizione Pol III è finemente regolata in condizioni di normalità,ma il processo perde d’equilibrio e modulazione durante la tumorigenesi. Un considerevole incremento dei trascritti Pol III accompagna, infatti, il processo di trasformazione neoplastica e potrebbe rappresentarne l’origine. Le cause molecolari di tale variazione trascrizionale restano sconosciute, così come il loro nesso con gli altri eventi cellulari associati alla cancerogenesi. Nel laboratorio del Prof. Martin Teichmann è stata identificata una proteina omologa alla subunità RPC32 della Pol III (Haurie et al., 2010). Tale proteina, battezzata RPC32beta, risulta ubiquitaria ed essenziale per la sopravvivenza cellulare. Invece, la presenza e l’attività di RPC32alpha (la variante nota in letteratura) sembrano limitate alle cellule staminali embrionali indifferenziate ed a quelle tumorali. L’overespressione di RPC32alpha, inoltre, favorisce ed accelera il processo neoplastico ed apporta un cambiamento drammatico all’espressione di molti markers tumorali e di un subset di geni Pol III. E’ verosilmile che tale subunità partecipi attivamente alla riprogrammazione trascrizionale durante la carcinogenesi, reindirizzando l’RNA polimerasi III su nuovi geni che poi contribuiscono alla trasformazione neoplastica. Alternativamente, il suo effetto potrebbe essere quello di modificare il tasso trascrizionale di geni Pol III, generando così uno squilibrio molecolare che induce la cellula all’oncogenesi. Il lavoro di tesi in questione ha portato all'identificazione, tramite esperimenti di Immunoprecipitazione cromatinica, ChIP cloning e Genome Wide Sequencing, dei geni trascritti dalle due varianti di Pol III: la Pol IIIalpha (che incorpora RPC32alpha) e la Pol IIIbeta (che invece si distingue per la presenza di RPC32beta). La localizzazione su scala genomica delle due polimerasi rivela la presenza di entrambe su molti geni Pol III, suggerendo un’attività ridondante per le due forme nella trascrizione di questi geni. Appare evidente, al contempo, che alcuni geni sono occupati solamente o preferenzialmente da una delle due varianti (tra questi geni, numerose Alu). La genome wide location delle due polimerasi ha condotto anche all’identificazione di nuovi loci PolIII. Tra questi degli pseudogeni dei tRNAs, alcuni snoRNA, delle MIRs (Mammalian-wide Interspersed Repeats). La funzione di tali RNAs nel processo di trasformazione neoplastica che vede partecipe RPC32alpha rimane ancora da chiarire. La presenza dell’intero macchinario Pol III in questi siti è stato confermata tramite immunoprecipitazione cromatica di RPC53, RPC39, Brf1, Brf2, TFIIIC35. 2011-03-31T22:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1333 Title: Novel insights into human RNA polymerase III transcription: non canonical termination and biogenesis of potential regulatory RNAs Authors: Orioli, Andrea Abstract: Transcription by human RNA polymerase III has been studied extensively to date, but many processes still need to be fully elucidated to get a more comprehensive picture. Here, we redefined the minimal sequence requirements for human RNA polymerase III termination and we investigated a novel kind of post-transcriptional gene silencing carried out by antisense AluRNAs derived from the 3’-UTR of human mRNAs. Starting from the observation that ̴ ¼ of human tRNA genes are enriched in canonical terminators located at ≥50 bp from the 3’-end of the tRNA coding sequence, we identified several novel non canonical terminators located further upstream at which RNA polymerase III terminates with different efficiencies, generally lower than those observed for termination at the canonical ≥T4 sites. Considering that more than one million of type 2 promoter elements are scattered through the human genome (tDNAs, Alu, MIR, etc), read-through at non-canonical sites could end up in the biogenesis of primary RNAs, with potential regulatory functions as previously observed for RNA polymerase III-derived miRNA, embedded in the 3’trailer of predicted type 2 promoter transcripts. Relaxed RNA polymerase III terminators could thus represent the evolution of a more sophisticated regulatory mechanism for the biogenesis of small RNAs. Additionally, we found that an antisense AluY RNA, transcribed from the 3’UTR of TERF2 mRNA is likely to trigger the silencing of its cognate mRNA by targeting its complementary sequence and speculated that the target specificity resides in its unique 3’trailer.; La trascrizione da parte della RNA polimerasi III umana è stata studiata estesamente negli ultimi anni, ma l’impressione è che molti processi debbano ancora essere chiariti. Nel presente lavoro abbiamo ridefinito i requisiti minimi di sequenza per avere terminazione da parte della RNA polimerasi III umana e investigato un nuovo modello di silenziamento genico post-trascrizionale mediato da Alu RNA antisenso trascritti dalla 3’UTR di mRNA umani. Partendo dall’osservazione che circa un quarto dei geni umani codificanti tRNA è arricchito in terminatori canonici posizionati a più di 50 pb dall’ estremità 3’ del tRNA maturo, abbiamo identificato nuovi terminatori non canonici, situati più a monte, a livello dei quali la RNA polimerasi III termina diversamente e con efficienza inferiore rispetto a quanto osservato al terminatore canonico ≥T4. Considerando che il genoma umano contiene più di un milione di promotori di tipo 2 (tDNAs, Alu, MIR, etc), il parziale riconoscimento di terminatori non canonici e la conseguente trascrizione di sequenze a valle potrebbe risultare nella sintesi di RNA, situati nel 3’trailer, con possibili funzioni regolative come già osservato nel caso di miRNA trascritti dalla RNA polimerasi III. L’uso di terminatori più deboli da parte della RNA polimerasi III umana potrebbe quindi rappresentare lo sviluppo di un sofisticato meccanismo regolativo finalizzato alla biogenesi di piccoli RNA. In secondo luogo, abbiamo scoperto che un AluY RNA antisenso, trascritto come parte della 3’UTR di TERF2 mRNA, è in grado di indurre il silenziamento del corrispondente mRNA e ipotizzato che la specificità nei confronti del proprio bersaglio risieda nel 3’trailer dell’Alu RNA. 2010-03-11T23:00:00Z http://hdl.handle.net/1889/1331 Title: Promiscuità enzimatica ed evoluzione molecolare:studio di una lattonasi da Sulfolobus solfataricus in grado di degradare agenti nervini Authors: Merone, Luigia Abstract: Si definisce promiscuità catalitica la capacità di un enzima di catalizzare reazioni aggiuntive al ruolo principale, che possono essere più o meno chimicamente differenti tra loro. Questa definizione si riferisce sia alla possibilità di catalizzare la trasformazione di substrati di natura diversa che di utilizzare differenti meccanismi di reazione e/o diversi siti catalitici1,2. L'enorme importanza legata allo studio della promiscuità enzimatica è sostanzialmente duplice. Da un punto di vista “teorico” è connesso con il riconoscimento molecolare, e, a più ampio raggio, con la biochimica degli organismi viventi. Questo ha conseguenze considerevoli nell'ambito dell'evoluzione delle specie. Da un punto di vista “pratico”, invece, la comprensione della promiscuità può facilitare il progresso della ingegneria proteica sia per applicazioni biomediche che industriali. Ed è con questo duplice scopo che si colloca il progetto di ricerca del seguente lavoro che ha scelto come modello di studio un enzima proveniente da fonte ipertermofila la cui funzione principale è quella di idrolizzare carbossilesteri ciclici (lattoni) e la sua funzione ancillare è la capacità di degradare fosfotriesteri di natura sintetica di cui fanno parte tutta una serie di inibitori irreversibili dell'acetilcolinestari (AChE), l'enzima chiave del sistema nervoso centrale umano. L'enzima oggetto di studio proviene dal microorganismo ipertermofilo archaeon Sulfolobus solfataricus presente nell'area vulcanica della Solfatara di Napoli ed è stato denominato SsoPox3. Per omologia di sequenza primaria è stato collocato nella superfamiglia delle amidoidrolasi, e per le sue proprietà cinetiche nel gruppo delle Lattonasi Fosfotriesterasi-simili (PLLs)4. SsoPox, infatti, idrolizza principalmente lattoni, in particolare acilomoserina lattoni (AHSL) e, come capacità ancillare, organofosfato fosfotriesteri (OPs). Di questo tipo di composti chimici fanno parte tutta una serie di pesticidi sintetici (clorpirifos, paraoxon, diazinon, ecc.) e gas nervini (sarin, soman, VX) apparsi sul pianeta per la prima volta negli anni '505. Per questa ragione enzimi capaci di degradare questi substrati sintetici si ritengono di recente evoluzione. Altri membri della superfamiglia delle amidoidrolasi sono in grado di degradare organofosfati come il paraoxon6. Il migliore enzima attualmente noto capace di degradare tali substrati è la fosfotriesterasi pPTE dal microorganismo mesofilo Pseudomonas diminuta7. Tale enzima idrolizza il paraoxon con una efficienza prossima al limite di diffusione di substrato, risultando così 10,000 volte più attivo in termini di specificità (kcat/KM) rispetto all'omologo ipertermofilo. E' in questo contesto che si inserisce l'obiettivo di questo lavoro di tesi: evolvere l'attività promiscua della lattonasi di S.solfataricus così da convertirla in una specializzata fosfotriesterasi. Questo per il duplice scopo di comprendere i meccanismi catalitici in grado di garantire molteplici attività enzimatiche coesistenti, e di rispondere alle persistenti domande di ottimizzazione di sistemi di decontaminazione/detossificazione degli scarichi tossici di organofosfati. La scelta di questo enzima modello è strettamente correlata con la sua elevata stabilità strutturale dipendente dalla fonte da cui proviene, che lo rende un perfetto candidato per approcci di evoluzione molecolare in vitro 8. L'intrinseca stabilità strutturale di un enzima, infatti, è un presupposto di notevole rilevanza per la sua evoluzione in quanto lo rende capace di sopportare molteplici mutazioni senza comprometterne l'impalcatura strutturale. Una strategia di evoluzione diretta (facendo convergere approcci “razionali” e “casuali” di mutagenesi) ha portato, in seguito alla caratterizzazione di diverse varianti, al mutante singolo SsoPoxW263F che mostra incrementata attività e specificità contro il fosfotriestere paraoxon di 30 e 16 volte rispettivamente, rispetto all'enzima wt. Inoltre, è stata testata la stabilità strutturale in presenza di diversi agenti denaturanti fino a incubazioni di 40h a temperatura ambiente, e in nessun caso s'è registrato annullamento dell'attività degli enzimi termofili. Al contrario in presenza di SDS l'enzima wt e la sua variante W263F mostrano un incremento della specificità di substrato verso il paraoxon, essenzialmente ascrivibile, a 25°C, ad un incremento della affinità. In tal modo la presenza del SDS nella miscela di saggio comporta un incremento di attività rispetto all'enzima non modificato di 150 volte per la variante SsoPoxW263F. Questa interessante proprietà è stata sfruttata per l'allestimento di un test dove l'enzima mesofilico pPTE e il termofilico SsoPox sono stati sottoposti alle medesime condizioni di stress da solventi organici e surfattanti per avere la “prova di concetto” che l'attività promiscua di un enzima termostabile rappresenta un buon punto di partenza per lo sviluppo di un robusto e competitivo catalizzatore bio-compatibile. Un altro approccio di evoluzione molecolare è stato utilizzato al fine di produrre un ibrido tra SsoPox e pPTE. Delle 14 mutazioni disegnate ed ottenute, per ricombinazione con l'enzima non modificato, una variante tripla contenente anche la mutazione nella posizione W263, risultava in un incremento significativo della costante catalitica (130 volte). Questo risultato conferma che quella posizione ha un ruolo chiave per l'attività idrolitica nei confronti del paraoxon. Inoltre è stata valutata la variazione dell'attività lattonasica nelle varianti ottenute con incrementata attività fosfotriesterasica. Ciò che è risultato interessante è che mentre si osserva un parallelo incremento dell'attività lattonasica verso il lattone sintetico Tiobutil--butirrolattone (TBBL), l'attività verso acilomoserina lattoni naturali risulta diminuita se non addirittura annullata, nel caso della variante tripla. Uno studio di simulazione di legame condotto su Silicon Grafics ha messo in evidenza la presenza di un'altra tasca di legame in cui si accomoderebbe il substrato TBBL. Questa tasca risulta distinta da quella identificata per il legame con un analogo di substrato tipo omocisteina lattone (C10HTL) ottenuto nella struttura di SsoPox risolta, in presenza e in assenza di questo analogo, durante questo lavoro di tesi grazie alla collaborazione con il gruppo del prof. E. Chabriere dell'Università di Marseille (Francia)9, 10. La conoscenza della struttura dell'enzima, degli effetti sulle attività enzimatiche principali e promiscue su tutta una serie di varianti dell'enzima qui ottenuti, ha permesso infine di formulare un'ipotesi sul differente meccanismo d'azione di SsoPox verso i due tipi di substrati: fosfotriesteri e lattoni. Referenze 1 O'Brien PJ, Herschlag D. Chemistry and Biology 1999; 6:R91-R105. 2 Bornscheuer UT, Kazlauskas RJ. Angew Chem Int Ed Engl. 2004; 43:6032-40. 3 Merone L, Mandrich L, Rossi M, Manco G. Extremophiles 2005; 9:297-305. 4 Afriat L, Roodveldt C, Manco G, Tawfik DS. Biochemistry 2006; 45:13677-86 5 Schrader G. Angew. Chem. 1950; 62: 471–3. 6 Roodvelt C, Tawfik DS. Biochemistry 2005; 44:12728-36. 7 Dumas DP, Caldwell SR, Wild JR, Raushel FM. J Biol Chem 1989; 264:9659-66. 8 Bloom JD, Labthavikul ST, Otey CR, Arnold FH. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2006; 103:5869-5874. 9 Elias M, Dupuy J, Merone L, et al. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007 63:553-5. 10 Elias M, Dupuy J, Merone L, et al. J Mol Biol. 2008 379:1017-28. 2009-12-31T23:00:00Z